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1.
【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。  相似文献
2.
西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
山羊脂肪酸合酶 (Fatty acid synthase,FAS)是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用.设计了shRNA-5544、shRNA-5936、shRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果.在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致.重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10×12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID_(50)法测定重组腺病毒滴度分别为6×10~8 PFU/mL(表达shRNA-5544序列)、5×10~8 PFU/mL(表达shRNA-5936序列)及6×10~8 PFU/mL(表达shRNA-NC序列),为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础.  相似文献
3.
腺病毒载体的研究进展   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
叙述了腺病毒的生物特性、腺病毒载体的发展进程和构建策略、在动物疫苗研究中的应用及其优势,同时阐述了腺病毒载体遇到的免疫学问题,并对腺病毒载体进行了展望,随着动物腺病毒载体的发展,它必将在控制人和动物传染病,特别是在病毒性传染病中发挥越来越重要的作用。  相似文献
4.
腺病毒栽体具有高效传递和表达基因的能力(尤其是在体外),在过去的15年里已经得到充分地证实.腺病毒载体由于宿主范围广泛和对人体的低致病性、病毒颗粒比较稳定、基因组较少发生重排等优点,已经成为最常用的痛毒载体之一.但由于细胞的靶向性和宿主的免疫反应限制了腺病毒载体的应用和发展,为此,对腺病毒载体进行了不断改进和完善,其潜在的应用价值也得到了广泛关注.现就对腺病毒载体的特点,改进和应用方面的研究进展综述如下.  相似文献
5.
[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PDNR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。  相似文献
6.
由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合到动物宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,成为重组疫苗和基因治疗研究的热点。本文就腺病毒载体的生物学特性、研究进展及在口蹄疫防治中发挥的重要作用进行综述。  相似文献
7.
采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。  相似文献
8.
[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PD-NR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。  相似文献
9.
应用 RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒 pShuttle-CMV 载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和 RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。  相似文献
10.
目前,腺病毒载体已成为基因治疗和重组疫苗研究的热点,是基础研究、基因治疗和重组疫苗开发等领域中的重要工具。本文就腺病毒载体的结构、构建、应用和改进方面的研究进展作一综述。  相似文献
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