布鲁氏菌S2 WboA基因缺失株的构建及免疫效果

 【目的】WboA基因编码光滑型布鲁氏菌脂多糖（LPS）O－侧链合成必须的糖基转移酶，该基因的缺失或破坏会影响布鲁氏菌光滑型表型的形成。本研究拟构建WboA基因缺失的重组粗糙型布鲁氏菌，以使布鲁氏菌弱毒疫苗与野毒株布鲁氏菌感染相区分。【方法】以猪源光滑型布鲁氏菌S2株为研究对象，通过同源重组将氯霉素抗性基因（Cmr）完全替代S2株的WboA基因，获得重组粗糙型布鲁氏菌rS2-WboA株。【结果】rS2-WboA株在适宜的培养基（TSA）上传50代后仍保持对氯霉素的抗性。用1×107 CFU rS2-WboA免疫Balb/c小鼠和豚鼠，1个月后均能通过平板凝集试验检测到粗糙型抗体。1×1011 CFU rS2-WboA菌攻毒Balb/c小鼠后，不会引起死亡，并且能抵抗200 CFU强毒M28的攻击。小鼠试验显示了rS2-WboA与原始株S2相似的保护性和更高的安全性，其保护性也略高于另一重组株rS2-WbkC。【结论】WboA可作为构建重组粗糙型布鲁氏菌疫苗株缺失的靶基因。  

牛布鲁氏菌病流行特点及综合防控措施

布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌引起的急性或慢性的人畜共患病,简称布病[1]。在动物中羊、牛、猪最易感,主要侵害生殖器官,引起胎膜发炎、流产、不育、睾丸炎等;人接触该病原菌污染物,通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道感染[2]。该病被农业部列为二类动物疫病,目前在我国畜群中仍时有发生,给畜牧业生产了和人类安全构成了一定威胁。  

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法，为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖（LPS）作为包被抗原，采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数，初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析，构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积，确定敏感性和特异性；通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测，比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为：抗原包被浓度为10 μg·mL^-1，最适包被液为碳酸盐缓冲液，最佳包被时间为2—8℃、16 h，最适血清稀释度为1﹕50，最佳封闭液为含有3%明胶的PBST，最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST，最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST，最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000，最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清，并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线（ROC）线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值（S/P）×100%=20%。在此临界值上时，敏感性为97.7%，特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示，本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。  

布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子，本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用，探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白，overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株，用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞，观察细胞形态变化，ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】 从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达，获得纯化的BP26蛋白，经SDS-PAGE验证正确，Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中，电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中，成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞，BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢，缺失株导致细胞大量脱落溶解，ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组，差异极显著（P＜0.01）, 而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组，LDH和IL-10均低于M5-90对照组，差异显著（P＜0.05）。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株，BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应，有细胞毒性作用，bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用，bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。  

牛布鲁氏菌病的诊断与预防措施

布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体引起的人畜共患传染病。由于患病的动物不仅易出现流产、不育、生殖器官炎症，还可经奶制品、流产物或其它途径感染人，导致人的波状热、关节痛及泌尿生殖系统疾病。因此，在给畜牧业造成严重的经济损失的同时，  

牛布鲁氏菌病的诊治

牛布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌引起的一种人畜共患病,主要侵害生殖器官,引起母牛流产,公牛发生睾丸炎和附睾炎。综述了该病的病原、流行病学、临床症状、病理变化、诊断,提出防治措施,以为该病的防治提供参考。  

流产布氏杆菌病的发病机制

牛布鲁氏菌病是一种非常重要的世界流行的动物传染病。在发展中国家流行范围广,经济损失严重。该病的病原是一种革兰氏阴性球杆菌,能够引起怀孕母牛胎盘坏死及间质性乳腺炎,新生小牛多患有纤维素性肺炎。就流产布鲁氏菌的致病性、对吞噬细胞和非吞噬细胞的侵袭力、在胞内的生存机制及阻碍吞噬细小体-溶酶体的粘附进行综述,尤其对获得性免疫反应如何抵抗布鲁氏菌感染作了重要的阐述。  

布鲁氏菌传染病的综合防控措施

布鲁氏菌传染病是由布鲁氏菌属细菌引起的人兽共患传染病,危害较大,以患畜传染人为主,人传人的实例很少见到。 1发生情况 在畜中牛、羊、猪最常发生,并可传染人和其他动物,我国将其列为二类动物疫病。临诊特征是生殖器官和胎膜发炎,导致流产、  

布鲁氏菌免疫保护抗原与抗病疫苗的研究进展

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的世界性人畜共患传染病,主要的防治方法是注射疫苗.但当前常用的布鲁氏菌病疫苗具有免疫成本高、时间短、保护效率低、毒力不稳定等问题.介绍了布鲁氏菌病的致病机理与防治,综述了布鲁氏菌病常用疫苗、基因工程疫苗以及免疫保护抗原的研究进展.  

肉牛常见传染病综合防治技术

牛患病是由于机体功能损害或因与外界环境失衡而引起,其结果是导致牛生长受阻、严重的还会死亡。因此,牛场必须坚持＂防重于治、防治结合＂的方针,使发病减少,而一旦发病,只要及时进行诊治,可使患病造成的损失与危害降到最低限度。