抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。  

实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR的原理、影响因素以及在植物病害和遗传育种方面的应用等进行了综述。  

利用实时定量PCR对瘤胃甲酸甲烷杆菌定量方法的建立与应用

 【目的】解决传统微生物评价方法存在的弊端，寻找快速、准确、灵敏的瘤胃微生物评价的新方法。【方法】利用实时定量PCR技术，以16S rDNA为靶序列，建立了瘤胃甲酸甲烷杆菌（Methanobacterium formicicum）的分子定量方法。【结果】采用本文所设计的引物、探针以及相应的PCR反应体系，检测极限可达到30拷贝（15个甲酸甲烷杆菌），与传统检测方法相比要更为迅速、灵敏。采用实时定量PCR技术所测得的细菌数量与采用传统的最大或然数记数法所测的细菌数量具有很高的相关性（r=0.957，P<0.01），表明采用实时定量PCR方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。利用所建立的方法对利鲁杂交肉牛和荷斯坦奶牛瘤胃液中甲酸甲烷杆菌进行了定量检测。结果表明，利鲁杂交肉牛瘤胃液中的甲酸甲烷杆菌浓度是荷斯坦奶牛的5.6倍。【结论】利用实时定量PCR技术建立的瘤胃甲酸甲烷杆菌的分子定量方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。  

柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测

【目的】为柑桔黄龙病的早期诊断和寄主体内病原菌的动态监测提供一种稳定、可靠的检验检疫技术。【方法】利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因rplJ/rplL设计了2对PCR引物CQULA03F/CQULA03R、CQULA04F/CQULA04R和1条TaqMan探针CQULAP1，以此为基础建立了常规PCR和TaqMan探针法、SYBR Green I荧光染料法两种荧光定量PCR（共3种）反应体系；确定了3种体系各自的检测灵敏度、特异性和准确性，据此对3种体系进行了比较；从2004年7月到2005年5月还利用常规PCR和TaqMan探针荧光定量PCR体系完成了对柑桔黄龙病病原菌在寄主体内的周年变化的动态监测。【结果】两种荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2～3个数量级，而TaqMan探针法由于使用了杂交探针，其特异性尤其可靠，另外两种定量PCR较小的产物片段使得它们具有更好的稳定性，加上荧光定量PCR方法本身受污染可能性小、操作简便等固有优势，使得前者更适合于柑桔黄龙病的检测。【结论】本研究建立的2种荧光定量PCR方法可以为柑桔黄龙病的病害早期诊断以及柑桔黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术。  

荧光定量RT-PCR法检测运输应激猪热休克蛋白mRNA转录水平

 【目的】探讨应激时热休克蛋白mRNA转录水平的变化。【方法】根据HSP90、HSP70和GAPDH mRNA序列，设计并合成引物，将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体，重组质粒经筛选、鉴定，体外转录出RNA，梯度稀释作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测，建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台，并用于检测长途运输猪心脏和肝脏中HSP70及HSP90 mRNA转录水平的改变。【结果】经1、2、4、6和10 h的运输应激后，组织中HSP70 mRNA的转录水平随着运输应激时间的延长一直呈现出上升的趋势，运输应激到10 h时HSP70 mRNA的转录水平升到最高，肝脏和心脏组织中HSP70 mRNA的转录水平分别为对照组的2.5和4.1倍；HSP90 mRNA的转录水平则随着运输应激时间的延长呈下降趋势。【结论】运输应激可以影响HSP mRNA转录水平的变化，并且对不同家族的HSP mRNA转录水平的影响不同；HSP70 mRNA的转录水平有望成为猪运输应激的判定指标之一。  

中国黄牛背最长肌中capnl mRNA表达与嫩度的关系

采用实时荧光定量PCR方法研究了中国黄牛背最长肌中capnl mRNA表达与嫩度的关系。结果表明，capnl mRNA表达量与宰后第3天的牛肉嫩度高度相关（r=0．855）。酪蛋白底物酶原分析表明，不同肌肉的μ-calpain潜在酶活性存在很大差异，而m-calpain潜在酶活性差异不大。capnl mRNA的表达可能是影响牛肉嫩度的主要因素。  

实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR逐步成为转基因检测的重要工具。  

绵羊肌肉LPL基因表达的发育性变化及其对肌内脂肪含量的影响

 【目的】研究绵羊肌肉中脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）基因mRNA的发育性变化规律及其对肌内脂肪沉积的影响。【方法】选取2、30、60、90和120日龄的雄性哈萨克羊和新疆细毛羊各6只（120日龄只有新疆细毛羊），屠宰后取背最长肌检测肌内脂肪含量，用荧光实时定量PCR法检测肌肉LPL基因mRNA表达水平，分析在不同时期的变化及其与肌内脂肪含量的关系。【结果】随着日龄的增加，雄性哈萨克羊的IMF（Intramuscular Fat）含量持续上升，各生长时期差异显著（P＜0.05），而新疆细毛羊的IMF含量在各生长时期无显著差异（P＞0.05），雄性哈萨克羊的IMF含量30～90 d期间极显著高于新疆细毛羊（P＜0.01）；雄性哈萨克羊肌肉LPL基因的表达量在2日龄时最高，60日龄时降到最低，然后逐渐上升，2日龄时LPL表达量极显著高于其它日龄（P＜0.01）。新疆细毛羊的表达量在2日龄时较低，30日龄时升到最高，随后下降，到90日龄时降到最低，然后又逐渐上升；30日龄表达量与2、90、120日龄差异极显著（P＜0.01），与60日龄差异显著（P＜0.05）；60日龄表达量与2、90、120日龄差异显著（P＜0.05）；哈萨克羊LPL基因2～60日龄的表达量与IMF含量呈负相关，相关系数为-0.625（P＜0.05）；新疆细毛羊IMF含量与LPL基因表达量无显著相关性。【结论】新疆细毛羊和哈萨克羊背最长肌肌内脂肪沉积的发育性变化不同，在生长发育早期，哈萨克羊随日龄的增加其IMF上升，新疆细毛羊在各时期保持一个稳定的水平；LPL基因在哈萨克羊生长早期对其肌内脂肪的沉积可能有负调控作用，而对新疆细毛羊无明显作用。  

紫杉醇及其前体在中国红豆杉植株中合成和积累部位探讨

研究紫杉醇及其重要前体物质巴卡亭Ⅲ在中国红豆杉(Taxus chinenesis)中合成和积累部位,通过HPLC分析代谢产物在中国红豆杉植物中的空间分布,定量PCR技术研究代表紫杉醇合成途径中不同步骤的6种关键酶基因在植株中的表达特征。结果表明,巴卡亭Ⅲ主要分布在针叶中,而紫杉醇主要分布在树皮和树根皮中;针叶中,紫杉醇代谢途径上游步骤的关键酶基因表达水平较高,树皮中催化紫杉醇侧链连接的酶转录表达水平高,而树皮中能检测到较高含量的6种关键酶基因的表达。表明紫杉醇的骨架结构主要在针叶中合成,而树皮中转化这些前体物质生成紫杉醇的能力较强,树根中含有完整的紫杉醇代谢酶系,暗示根组织培养是生产紫杉醇很有前景的方法。进一步建立了组织扦插培养红豆杉离体组织体外生产紫杉醇的系统。在茉莉酸甲酯的诱导下,红豆杉针叶在体外能够生产紫杉醇;树皮中由于缺乏足够的前体物质,离体培养中紫杉醇含量不断下降;枝叶培养中,产生的紫杉醇主要集中在树皮中。上述研究结果暗示,紫杉醇及其前体物质在中国红豆杉体内存在转移现象。  

不结球白菜幼苗耐热性机制初步研究

以不结球白菜品种苏州青(耐热)和矮脚黄(不耐热)幼苗为材料进行热激处理(40℃,0、6、12、24、48、72和96 h),测定了热激处理对不结球白菜叶片中保护酶活性、丙二醛(MDA)含量以及膜透性的影响,同时利用实时定量PCR(qPCR)技术检测叶片中BcHsp1和BcHsp2耐热基因的表达变化。结果表明:热激处理后,耐热品种叶片中SOD、POD和CAT活性的增幅大于不耐热品种;不耐热品种叶片中丙二醛含量和电解质渗透率的增幅大于耐热品种;相对于不耐热品种,耐热品种热激蛋白基因具有明显稳定的热激诱导表达特性。