犬干扰素-γ的稀释复性及活力测定

文章探讨了不同折叠促进剂、加样方式、温度、pH在稀释法复性条件下对重组犬IFN-γ体外折叠的复性影响。结果表明,0.5mol·L-1精氨酸、0.5mol·L-1盐酸胍、2.0mol·L-1尿素均能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,其中精氨酸的效果最好。在4℃、pH8.0、精氨酸浓度0.5mol·L-1,蛋白浓度0.15mg·mL-1及脉冲加样操作方式下,复性后重组犬IFN-γ的活性为1.35×104U·mL-1,比活为3.74×106U·mg-1。  

尿素浓度梯度复性重组牛白细胞介素-2

尿素浓度梯度已成功用于多种重组蛋白的复性,对尿素浓度梯度复性rbIL-2进行研究,结果表明:调整变性rbIL-2的浓度在4 mg/mL左右,添加DTT使其达到10 mmol/L,4℃搅拌过夜,4℃分别对4、3、2、1 mol/L尿素,50 mmol/L Tris.Cl,pH 8.5透析12 h,然后再对pH 8.5的PBS透析12 h,可成功对rbIL-2复性,复性率达70%左右。生物活性测定表明得到了具有较高生物活性的rbIL-2。  

具生物活性的重组鸡催乳素的制备

将鸡催乳素(PRL)成熟肽cDNA片段插入原核表达载体pRSETA的NheI和Hind III位点之间,构建重组表达质粒pPRL-SCAU.将此质粒转化大肠杆菌Escherichia coli菌株BL21(DE3),将重组菌在含氨苄青霉素的LB培养基中培养,再经IPTG诱导,可以诱导表达相对分子质量约为24 500的重组鸡PRL.经0.1 mmol/L IPTG诱导4 h后,表达量达到最高,占总菌体蛋白的30%左右.表达的重组鸡PRL含组氨酸标记,以包涵体形式存在,可经50%Ni-NTA树脂分离纯化,然后在透析复性后分离出可溶性部分.将此可溶性重组鸡PRL对3月龄的鸽子在左侧嗉囊处相同位置隔24 h2次皮内注射,能够显著促进嗉囊上皮的增生.与天然鸡催乳素的增生效果相比,所表达的重组鸡PRL的生物学活性为天然催乳素的17%至25%.  

人β2微球蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。  

不同基因型小麦生育后期POD同工酶酶谱分析

利用复性电泳技术对小麦品种强筋小麦新麦19号和硬粒小麦生育后期的POD酶谱进行了分析.结果表明,强筋小麦与硬粒小麦子粒的POD酶谱有明显的差异,140kD和39kD是强筋小麦所特有的酶带;硬粒小麦活性较强筋小麦高,在146～96kD、23～10kD两区域均有酶的表达.强筋小麦和硬粒小麦的倒1、倒2两个不同叶位的POD酶谱中有4条酶带很保守,分别是300kD、52kD、39kD和37kD.  

O型口蹄疫病毒VP1基因原核表达及蛋白纯化

以O型FMDV重组质粒pMD18T-O-VP1为模板，利用PCR技术扩增得到O型FMDV-VP1基因片段，将此基因片段与原核表达载体pET32a连接构建重组表达载体pEq32a-O-VP1，经PCR和测序鉴定后，用WIG诱导归1基因的表达，收集不同诱导时间的菌液，进行SDS-PAGE电泳，摸索掌握最佳诱导时间，切取最佳诱导时间电泳胶片做Westem-blotting，分析检验表达产物与其抗血清的反应性。结果显示，分子量约为45ku的蛋白条带反应显著，能被口蹄疫阳性血清识别，表明FMDV-VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达，纯化复性的表达蛋白有望开发为诊断抗原和多肽疫苗。  

拟南芥转录因子AGL47的原核表达与包涵体复性研究

AGL47是拟南芥第五染色体上At5g55690基因编码的1个转录因子,属于MADS-box蛋白质家族,前期研究显示,At5g55690基因受磷胁迫特异诱导表达,极有可能在磷代谢调控中发挥重要的作用.为了进一步鉴定该基因的功能,本研究克隆At5g55690基因全长ORF,构建重组表达载体pPET-28 a-At5g55690,转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),在1 mmol.L-1IPTG诱导下,成功实现了AGL47蛋白的原核表达.可溶性鉴定结果显示,融合蛋白以包涵体的形式存在.对包涵体进行纯化,变性和复性后获得了可溶性目的蛋白.  

抗伊维菌素scFv蛋白质的变复性及纯化

基因工程技术的发展扩大了蛋白质研究领域，简化了研究步骤。原核表达系统表达目的蛋白质具有操作简单、培养周期短、高效经济、便于纯化等优点，但大部分表达的蛋白质是以包涵体的形式存在。包涵体是蛋白质在细胞内凝集形成的无活性不溶于水的固体颗粒，含有重组蛋白质及核糖体元件、内毒素、外膜蛋白质、RNA聚合酶和脂体等。在高浓度的变性剂如尿素、盐酸胍等中由于氢键、疏水键被破坏，包涵体蛋白质完全伸展而溶解，在复性剂中可重新折叠形成天然结构而重新获得活性[1]。  

桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH结合区蛋白的原核表达、纯化及复性

为了剖析桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH蛋白的结合活性,从桃果实中提取总RNA,采用RT-PCR方法,以桃果实RNA逆转录的cDNA为模板,扩增出ABAR/CHLH基因的结合区功能片段C369,回收目的片段并测序,基因片段长度为1 121 bp,编码369个氨基酸残基,分子量约为40 kD。利用BamHⅠ和NotI酶切位点将该片段编码区插入原核表达载体pET-28a（＋）中,构建ABAR/CHLH基因片段原核表达载体pET28a-C369,经菌落PCR和测序确证后,转化E.coliRosetta（DE3）,通过IPTG诱导其表达His-CHLH融合蛋白。通过SDS-PAGE检测及Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,并用纯化复性的His-CHLH C369融合蛋白制备抗体。  

春小麦原种互助红15号生产技术

提纯复性是不断繁殖优质种子,保持和提高良种种性,延长良种使用年限,有计划的实行良种更新,促进农业增产的有效措施.