猪α-干扰素的原核表达

重组质粒pMDIFN-α中的猪α-干扰素基因经双酶切，亚克隆到原核表达载体pET-．28a，构建了重组表达质粒pETIFN-α，经过SDS-PAGE蛋白质电泳，测得表达蛋白的相对分子质量约为26500．表达蛋白的Western-blotting分析显示：改进后的半干胶转印免疫印迹法灵敏度高、特异性强、重复性好；获得的重组融合蛋白具有良好的反应原性．  

烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

    为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein, Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3 h后,使用终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4 h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.  

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌S4074菌株毒素Ⅰ的序列,设计了1对引物,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ的结构基因(aoxICA),扩增的DNA片段大小为3 640 bp(4 687～8 326 bp),将其克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定和序列测定后,进一步将其插入pET-28a中构建了原核表达载体,SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达,而且表达的蛋白质具有免疫学活性.利用表达的蛋白作为抗原包被酶标板,建立了检测毒素Ⅰ血清抗体的ELISA方法.临床应用表明,该方法可用于APP强毒株感染的检测.  

人促性腺激素释放激素及其转运肽基因的克隆、表达与纯化

研究根据GenBank中已发表的人GnRH2基因mRNA序列以及转运肽基因核苷酸序列,借助Oli-go4.1设计了一对寡核苷酸引物,以引物3'末端的短互补序列退火形成小段双链,从而互为模板和引物,通过引导合成长达90bp的目的序列GnRH/TRS。将其克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pYC1,经酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,进一步的序列分析确认其中GnRH/TRS序列的正确性。pYC1经BamHI和EcoRI酶切得到GnRH/TRS片段,然后将此片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pYC2。经酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC2,并转化到大肠杆菌BL21(ED3)plyS实现原核表达。IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的约28ku的融合蛋白,光密度扫描对表达产物进行初步定量,表达产物约占菌体总蛋白的33.3%,表达产物经GlutathioneSepharose4B层析纯化后,得到了纯度较高的GST-GnRH/TRS融合蛋白,为进一步科研和实际应用奠定基础。  

鹅γ-干扰素成熟蛋白的表达及其生物学活性研究

【目的】检测重组鹅IFN-γ的生物学活性。【方法】将鹅IFN-γ成熟蛋白基因分别克隆到原核表达载体pET30a，杆状病毒转移载体pMelBacA和pBlueBacHis2A。对鹅IFN-γ成熟蛋白进行原核和真核表达系统表达；利用体外活性试验检测表达产物的生物学活性。【结果】原核和真核表达系统表达了重组鹅IFN-γ成熟蛋白，并制备其原核表达产物的多克隆抗体；重组鹅成熟IFN-γ可以诱导鹅巨噬细胞产生NO，并能抑制GPMV在鹅胚成纤维细胞中的增殖。【结论】重组鹅成熟IFN-γ具有鹅巨噬细胞激活活性和抗病毒活性。  

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.  

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。  

鸡MHCⅡβ链基因的克隆和表达及其抗体制备

用自行设计的1对引物,通过RT-PCR从鸡脾细胞中分别克隆了鸡MHCⅡβ链基因片段,大小为798 bp.核苷酸测序结果表明,与已登录的基因序列同源性为95%.将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了pGEX-4T-1-chMHCⅡβ.经诱导表达,获得分子大小约为53 000的融合蛋白,其中chMHCⅡβ链大小约27 000.经亲和层析,获得纯化GST-β融合蛋白,进一步用此蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡MHCⅡβ链抗体.经过琼扩和ELISA检测,表明该融合蛋白具有良好的抗原性.  

北京长白杂交猪IgG H链基因CH2-CH3的克隆、序列分析及表达质粒构建

根据GenBank中注册的猪IgG H链基因cDNA CH2 CH3序列(SSU03780),设计了含KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从北京长白杂交猪肠系膜淋巴结细胞扩增猪IgG H链基因CH2 CH3序列.将PCR产物纯化回收后,插入到含LacZ基因的克隆载体pGEM-T Easy中,转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆.将所克隆的目的片断亚克隆到原核表达载体pQE 30,构建重组质粒pQE 30/PIgG CH2 CH3.将重组表达质粒转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果表明,本研究克隆了猪IgG H链基因CH2 CH3序列,全长663 bp,编码221个氨基酸,利用Gentyx version 6.0软件将CH2 CH3基因的核苷酸序列与GenBank中的参考序列比较,其核苷酸序列同源率为99.551%,推导的氨基酸序列同源率为100%.将pQE 30/PIgG CH2 CH3转化JM 109感受态细胞,表达的融合蛋白相对分子质量约为26.95 ku,经IPTG诱导2 h,表达量约占菌体总蛋白41.5%.  

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

 【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs, GhCOMT1（GenBank登录号为FJ479708）、GhCOMT2（GenBank登录号为FJ479709）和GhCOMT3（GenBank 登录号为FJ848869）分别具有1 101 bp、1 098 bp、1 071 bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2 mmol•L-1IPTG在37℃下诱导6 h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。