利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

正小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf,WBD)是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)专化性传播,介体传毒成为病害流行的重要中心环节[1]。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白(immunodominant membrane protein, IMP)与介体异沙叶蝉肌动蛋白互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。     

我国主要麦区农户施肥评价及减肥潜力分析

【目的】明确我国主要麦区农户小麦施肥存在的问题及减肥潜力,为科学施肥、合理减肥提供依据。【方法】连续3年对我国主要麦区的小麦种植户进行施肥调研和取样,基于农户产量、养分需求量和土壤养分供应水平对其施肥状况和减肥潜力进行评价和分析。【结果】我国主要麦区农户小麦产量和生物量平均为6.0和13.2 t·hm ^-2,二者极显著线性相关。小麦产量与施肥量和土壤养分无显著相关。我国小麦氮（N）、磷（P₂O₅）和钾（K₂O）肥用量平均分别为191.1、112.8和53.4 kg·hm ^-2,春麦区农户氮、磷和钾肥用量平均分别为171.7、108.9和10.6 kg·hm ^-2,旱作区分别为154.3、111.8和32.6 kg·hm ^-2,麦玉区分别为236.4、128.1和74.0 kg·hm ^-2,稻麦区分别为177.5、77.0和71.8 kg·hm ^-2。就施氮量而言,春麦区过量施氮的农户较少,为34%,其次是麦玉区、稻麦区和旱作区,分别为42%、55%和63%;产量较低的农户是氮肥减施的重点,减氮潜力最高达43.6%,平均需减氮2.3—135.5 kg·hm ^-2。过量施磷问题比较突出,各麦区施磷过量的农户分别占63%、87%、68%和57%,即使小麦高产时,仍有超过50%的农户施磷过量;各麦区不同产量等级的农户均需减施磷肥,减磷量平均为3.8—91.1 kg·hm ^-2,旱作区减磷潜力最大,达55.6%。施钾状况因麦区而异,在春麦区,主要问题是施钾不足,占84%,平均需增施钾肥22.8 kg·hm ^-2;旱作、麦玉和稻麦区,减钾潜力分别达43.2%、25.7%和56.0%;产量较低的农户是减钾的重点,平均需减钾31.7—45.9 kg·hm ^-2。【结论】我国农户施肥状况和减肥潜力因农户产量和麦区不同存在差异,中低产农户过量施肥问题较为严重,应注意根据产量适量减少施用氮、钾肥,所有农户均需警惕磷肥过量投入问题,其中旱作区氮、磷肥减施潜力最高,稻麦区减钾潜力最高。     

番茄ShARPC5抗白粉病功能分析

【目的】白粉病（powdery mildew）是番茄生产上的重要病害,严重影响番茄的产量。番茄基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）复合体是肌动蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子,能够参与包括响应外界胁迫等多种细胞学过程。本研究通过对番茄ARPC5（actin-related protein C5）进行克隆和抗病功能验证,为番茄基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面打下基础。【方法】从番茄LA1777（Solanum habrochaites）cDNA中PCR扩增ShARPC5,使用DNAMAN 6.0进行多序列比对;MEGA 6.0构建系统发育树;应用在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种白粉菌（Oidium neolycopersici,On-Lz）后高感品种Moneymaker（MM）和高抗品种LA1777中番茄ARPC5的表达特征,分析白粉菌侵染与ARPC5表达的相关性。应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在番茄中的抗病功能,观察沉默株和野生型株系接种后表型变化,利用台盼蓝和DAB染色法检测植株产生过敏性坏死和H₂O₂的能力,并检测ShARPC5沉默后一些与植物抗病相关标记基因的表达变化。采用农杆菌浸花法遗传转化拟南芥过表达ShARPC5植株,观察转基因和野生型株系接种后表型变化,并统计单病斑分生孢子数。【结果】从番茄品种LA1777中克隆到ShARPC5,编码132个氨基酸残基,包含一个保守的P16-Arc结构域。与番茄MM-白粉菌亲和互作相比,非亲和互作的番茄品种LA1777在接种白粉菌后,ShARPC5显著上调表达,尤其在接种后18 h。在番茄上沉默ShARPC5能够增加植株对白粉菌On-Lz的敏感性,防卫反应基因PR1b1显著下调表达。组织学观察显示与对照植株相比,ShARPC5沉默植株接种后诱导产生过敏性坏死和活性氧减少。在烟草上瞬时过表达ShARPC5能够诱导产生坏死斑。相反,在拟南芥上过表达ShARPC5能够增加植物的抗病性。【结论】ShARPC5是番茄响应白粉菌侵染的重要基因,可减轻番茄白粉病的发病程度,在番茄抗白粉病机理研究方面具有较大的应用价值,可作为番茄抗白粉病分子育种的一个候选基因。     

我国主要麦区主栽高产品种产量差异及其与 产量构成和氮磷钾吸收利用的关系

【目的】明确主栽高产品种产量差异与产量构成、氮磷钾吸收利用的关系,对于通过选育优良品种,进一步优化养分管理和栽培措施,缩小产量差,以指导我国主要麦区小麦的高产优质生产。【方法】于2016—2017年度在我国黄淮北片、黄淮南片和长江中下游3个主要冬麦区进行田间试验,种植各麦区主栽高产品种,研究高产小麦品种产量差异及其与干物质累积、产量构成和氮磷钾吸收利用之间的关系。【结果】黄淮北片、黄淮南片和长江中下游麦区籽粒产量均存在较大差异,分别介于7 751—8 702 kg·hm ^-2、7 302—8 413 kg·hm ^-2、5 554—到6 294 kg·hm ^-2。各麦区品种高产的原因不同,黄淮北片麦区,高产品种具有高的地上部生物量和收获指数,穗数也是高产的原因;黄淮南片麦区高的收获指数和穗粒数是高产的关键;长江中下游麦区高产的主要原因是高的收获指数和千粒重。黄淮北片麦区,高产品种有低的籽粒含氮量和需氮量以及高的氮生理效率;黄淮南片麦区,高产品种茎叶含磷量和需磷量较低,但磷生理效率和茎叶含钾量较高;长江中下游麦区,高产品种的籽粒含钾量低,籽粒含磷量和茎叶含磷钾量高,地上部氮磷吸收量高,磷生理效率低于而需磷量高于对照品种。【结论】总体来看,黄淮北片麦区鲁原118、黄淮南片濮麦168、长江中下游麦区华麦7号等具有较好的产量表现;在我国主要麦区,地上部生物量和收获指数仍是高产的关键,同时提高地上部养分吸收利用和养分收获指数,才能提高生理效率,降低养分需求量,实现小麦高产优质。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

陕西省小麦不同部位镰刀菌分离鉴定及毒素化学型分析

为明确陕西省小麦不同部位镰刀菌种群结构及其毒素化学型，于2022年小麦灌浆期分别从陕西省渭南市、宝鸡市、咸阳市、西安市采集小麦穗部、茎秆以及茎基部具有明显病状的样品，采用单孢分离法获得镰刀菌菌株，并使用分子生物学鉴定其种群结构及毒素化学型。结果表明，从采集的样本中共分离到156株镰刀菌菌株，其中发生在穗部的赤霉病以及发生在茎秆的秆腐病的优势病原菌均为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），主要以15-ADON化学型为主；发生在茎基部的茎基腐病的优势病原菌为假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum），其15-ADON和3-ADON化学型占比差异不大；未检测到NIV毒素化学型的镰刀菌。以上结果说明，小麦不同部位对镰刀菌毒素化学型可能不存在选择性，小麦茎基部与穗部和茎秆的镰刀菌毒素化学型不同，原因可能是由优势病原菌不同造成的。     

高分子保水剂对陕北山地苹果园土壤水分以及果树生长、产量和品质的影响

针对陕北山地果园的干旱缺水、灌溉条件差等问题,开展了高分子保水剂在陕北山地苹果园的应用技术的研究,为陕北山地果园施用保水剂提供理论依据。以榆林子洲山地果园的9年生‘烟富六号’为试材,设置50、100、150 g/株的3个保水剂处理,穴施在距离树体1 m的两侧处,以不施用保水剂为对照,分析不同用量的保水剂对果园的土壤含水量以及苹果树的生长发育、产量和品质的影响。结果表明,施用保水剂可以提高土壤含水量,促进树体的生长,提高产量和果实品质,研究结果表明,在陕北山地果园中以100 g/株的施用量效果最佳。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响

【目的】克隆中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤-2’芪合酶（stilbene synthase）基因（STS）并研究其功能,为提高欧洲葡萄（V. vinifera）的白粉病抗性及品质提供依据。【方法】利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因VqSTS9和VqSTS21,构建植物过表达载体;用无核白单芽茎段诱导出分生愈伤组织,作为农杆菌介导法遗传转化的受体材料,获得抗性植株,经过不同水平检测,确定转基因植株;对野生型和转基因植株叶片人工接种葡萄白粉病菌（Uncinula necator）,通过显微技术观察叶片受白粉病菌侵染后的情况,比较两者对白粉病的抗性;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析野生型和转基因植株在自然条件和接种白粉病菌后STS及其相关基因的表达,用高效液相色谱法（HPLC）检测转基因植株中芪类物质的种类与含量。【结果】同源序列克隆得到VqSTS9（JQ868689）与VqSTS21（JQ868677）的cDNA序列,长度为1 179 bp。经PCR和Western blot检测,鉴定出过表达VqSTS9无核白植株4株和过表达VqSTS21无核白植株3株。显微观察发现,与野生型植株相比,转VqSTS9 和VqSTS21植株叶片上的菌丝生长较慢,表现出对白粉病的抗性。qRT-PCR结果表明,自然生长条件下,与野生型植株相比,转VqSTS9和VqSTS21植株STS的表达量提高,STS上游苯丙氨酸裂解酶基因（PAL）、下游白藜芦醇糖基转移酶基因（RSGT）、转录因子基因（MYB14、MYB15）的表达量均不同程度上升,而查尔酮合成酶基因（CHS）表达量降低;人工接种白粉病菌后,与野生型植株相比,转基因植株STS表达量显著上调。高效液相色谱分析表明,自然条件下,芪类物质主要以反式云杉新苷形式存在,转基因植株芪类物质的含量高于野生型植株;在接种白粉病菌诱导表达后,除了反式云杉新苷,还产生了反式白藜芦醇和葡萄素,即转基因植株体内芪类物质的种类和含量均有所增加。【结论】将VqSTS9、VqSTS21转入无核白后,转基因植株STS的表达量增高,芪类物质的含量与种类增加,并抑制白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’携带的VqSTS9和VqSTS21能够增强欧洲葡萄对白粉病的抗性,‘丹凤-2’可用作葡萄抗病性育种的种质资源。     

北方麦区小麦产量与籽粒氮磷钾含量对监控施钾和土壤速效钾的响应

【目的】分析我国北方麦区监控施钾下小麦产量与养分吸收分配变化与土壤速效钾的关系,为节约钾资源,实现小麦丰产优质可持续发展提供理论依据。【方法】于2018—2020年在我国北方麦区43个地点进行田间试验,研究不同土壤速效钾水平下监控施钾对小麦产量、产量构成、籽粒氮磷钾含量及养分吸收分配的影响。【结果】北方麦区农户小麦施钾不足和过量问题同时存在。小麦产量随土壤速效钾含量升高显著增加,在土壤速效钾含量150—180 mg·kg^-1时,小麦产量达到最高,为6 340 kg·hm^-2。土壤速效钾过高并不能持续提高小麦产量,当土壤速效钾含量>180 mg·kg^-1时,小麦产量显著降低,平均为5 409 kg·hm^-2。与农户施肥相比,在土壤速效钾含量<90、90—120、120—150和>180 mg·kg^-1时采用监控施肥技术增加了钾肥用量,在速效钾含量150—180 mg·kg^-1时减少了钾肥用量,各土壤速效钾水平下采用监控施肥技术施用钾肥均提高了小麦产量,且在速效钾含量<90和>180 mg·kg^-1时显著增产。土壤有效磷含量>30 mg·kg^-1时,土壤速效钾含量120—150或>180 mg·kg^-1时,不施钾肥小麦产量有降低的趋势。土壤速效钾含量升高显著提高了小麦籽粒氮含量,农户施肥和监控施肥处理的籽粒氮磷钾含量无显著变化,速效钾含量>180 mg·kg^-1时不施钾肥的小麦籽粒磷钾含量显著降低。速效钾含量>150 mg·kg^-1时,监控施肥的钾肥偏生产力与钾肥吸收效率较农户施肥显著提高。【结论】在北方麦区,土壤速效钾含量150—180 mg·kg^-1时,合理施肥可使小麦产量达较高水平,但当土壤有效磷较高,超过30 mg·kg^-1时,不施钾肥小麦有减产风险。应根据土壤速效磷钾和小麦产量水平监控施肥,合理确定钾肥用量,实现北方麦区小麦丰产高效生产。     

山东省多主棒孢对三种常用杀菌剂的敏感性监测及对氟吡菌酰胺的抗性

【目的】由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的黄瓜靶斑病是世界公认的黄瓜三大病害之一,严重影响着黄瓜的产量和品质。随着防治药剂的连续使用,其抗药性问题日益突出。本研究旨在明确山东省多主棒孢对常用杀菌剂的抗性情况,为黄瓜靶斑病的药剂防治提供理论依据,同时筛选高效混配药剂为多主棒孢的抗药性治理提供数据支持。【方法】从山东省不同地区采集、分离纯化获得140株多主棒孢,采用室内菌丝生长速率法测定多主棒孢对3种常用杀菌剂（苯醚甲环唑、咪鲜胺和氟吡菌酰胺）的敏感性,并利用Modeller v9.19程序同源建模及AutoDock4.2.6分子对接软件包分析多主棒孢对氟吡菌酰胺的抗性。结合室内菌丝生长抑制和离体叶片防治效果试验筛选氟吡菌酰胺和咪鲜胺的复配最佳配比。【结果】经过异常值分析并剔除,敏感菌株频率分布均呈单峰,分别确定苯醚甲环唑对多主棒孢121株敏感菌株的EC₅₀范围为0.29—6.80 μg·mL^-1,平均EC₅₀值为2.44 μg·mL^-1;咪鲜胺对129株敏感菌株的EC₅₀范围为0.01—0.57 μg·mL^-1,平均EC₅₀值为0.16 μg·mL^-1;而氟吡菌酰胺对136株多主棒孢的EC₅₀范围为0.56—47.54 μg·mL^-1,平均EC₅₀值为6.94 μg·mL^-1。经测序分析发现31.62%多主棒孢菌株SdhC亚基发生S73P点突变。分子对接结果表明,SdhC亚基上发生S73P突变后,氨基酸的刚性增强,并且空间位阻变大,使氟吡菌酰胺与Ser73之间的氢键作用消失,从而亲和力降低,导致抗药性的发生。交互抗性分析结果表明氟吡菌酰胺与咪鲜胺不存在交互抗性,两者以7﹕3混用增效系数1.84,表现为增效作用,且相同剂量处理下,混剂的防治效果高于两个单剂处理的防治效果。【结论】山东省不同地区多主棒孢群体对不同杀菌剂的敏感性存在差异,对氟吡菌酰胺已产生不同程度的抗性,其中SdhC上点突变S73P的发生频率相对较高,导致病原菌琥珀酸脱氢酶与氟吡菌酰胺的结合能力下降。氟吡菌酰胺与咪鲜胺以7﹕3混用能够提高防治黄瓜靶斑病的效果,建议生产上可将氟吡菌酰胺与咪鲜胺交替或混合使用,用于治理目前多主棒孢对氟吡菌酰胺等SDHI类杀菌剂的抗性问题。