草鱼出血病分子流行病学及GCRV多样性研究

[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为"肠炎型"症状,且检测发现其病原多属于GCRV基因型Ⅲ型。对GCRV的多样性分析表明,不同分离株同源蛋白的同源率高达93%以上,却被给予完全不同的名称,给GCRV多样性研究带来一定的困难;同一基因型不同分离株同源蛋白间的变异位点较少,且功能位点发生变异的更少;不同基因型不同分离株同源蛋白间的保守位点较少,且这些保守位点中只有极少数位点为功能位点;不同基因型分离株同源结构蛋白间存在较大的差异,且同源非结构蛋白间的差异更为显著。[结论]草鱼出血病不同临床症状可能与其病原基因型不同有关。     

地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针.分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低.说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强、简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测.     

鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响，并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选，采用正交实验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明，鰤鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25 ℃、盐度5、pH 6.5±0.2；经筛选，鰤鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉，促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾（K2HPO4）和氯化钙（CaCl2）；确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1，酵母粉15 g·L-1，K2HPO4 0.75 g·L-1，CaCl 20.2 g·L-1（单独灭菌），氯化钠（NaCl2）5 g·L-1，pH 6.5±0.2。     

吉富罗非鱼mIgD基因恒定区序列的原核表达及多克隆抗体的制备

实验采用原核表达方法成功获得吉富罗非鱼m Ig D基因恒定区融合蛋白,同时利用纯化的MIGD融合蛋白,制备了兔抗MIGD多克隆抗体。ELISA检测MIGD融合蛋白效价高达1∶512 000,说明MIGD蛋白具有较强的免疫原性,可以诱导罗非鱼机体产生相应较强的免疫应答。     

五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜的体外抑制作用

采用琼脂扩散法,分别测定五味子(Shisandra chinensis)、黄精(Polygonatum sibiricum)对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的体外抑菌作用;选用倍比稀释法确定五味子、黄精对副溶血弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用改良微孔板法(MTT)评价两种中草药液对溶藻弧菌生物膜形成的影响。结果表明,两种中草药都有不同程度的抑制副溶血弧菌的作用,五味子对副溶血弧菌的抑菌圈直径为18.67(±0.2)mm,MIC为1.56 mg/m L,MBC为3.125 mg/m L;黄精的抑菌圈直径为11.26(±0.6)mm,MIC和MBC分别为1.56、3.125 mg/m L。当药物浓度达到3.125 mg/m L以上时,五味子和黄精对副溶血弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用。     

鲍消化道及其养殖水体异养菌的耐药性研究

采用纸片扩散法对分离自福建省皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)消化道及其养殖水体中的284株异养细菌(其中消化道菌131株,水体菌153株)进行药物敏感测试,以期了解其耐药性概况。结果显示,皱纹盘鲍消化道与养殖水体异养菌对多种抗菌药物的耐药率差异不明显,大部分菌株对青霉素、卡那霉素、庆大霉素、利福平产生耐药性,耐药率最高达83.95%,而对诺氟沙星、恩诺沙星、氯霉素耐药率较低,受试的水体异养菌对诺氟沙星耐药率为0;不同来源菌株的多重耐药(multiple antibiotic resistance,MAR)现象普遍,消化道及其养殖水体异养菌的多重耐药率均值分别为59.15%和51.31%。该研究同时发现相同分离源的菌株对青霉素、卡那霉素、庆大霉素和利福平的耐药率呈现一定的季节波动规律,消化道异养菌于9月耐药率最低,而水体异养菌耐药率在6月最低。结果表明,皱纹盘鲍消化道及水体异养菌的多重耐药率较高,耐药状况较严重。     

注射溶藻弧菌疫苗对南美白对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌疫苗注射南美白对虾,测定了弧菌疫苗对南美白对虾免疫指标的影响以及疫苗的免疫保护作用。结果表明,注射溶藻弧菌疫苗后,血清凝集效价增强,24 h时活力达到最高值,尤其是1.08×108cell/ml组的凝集效价升高最明显,为对照组的6.0倍;在24 h时,3个试验组的凝集效价均明显高于对照组(P<0.05)。溶菌活力注射后6 h即达到最高值,1.08×107、1.08×108cell/ml组的溶菌活力明显高于对照组(P<0.05)。抗菌活力在注射后3 h时最高,明显高于对照组。溶血活力在注射疫苗后有所增强,注射后6 h时1.08×106、1.08×107cell/ml组的活力达到最高,而1.08×108cell/ml组12 h时活力达到峰值。注射疫苗对血清超氧化物歧化酶活力基本没有影响。1.08×106、1.08×107、1.08×108cell/ml对南美白对虾的免疫保护率分别为46.3%、61.0%和75.6%。     

人IgG诱导尼罗罗非鱼特异性抗体分泌细胞的ELISPOT检测

通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测了经人 IgG 免疫后尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)头肾、外周血和脾脏中的特异性抗体分泌细胞(antibody secreting cell, ASC)数量。结果表明, 首次免疫 1 d 后可在头肾中检测出 ASC, 而外周血和脾脏第 3 天才能检测出 ASC; 头肾、外周血以及脾脏中的 ASC 均在第 12 天达到峰值, 随后头肾, 外周血中的 ASC 数量显著减少, 而在脾脏中 ASC 数量减少不显著。二次免疫 1 d 后在头肾、外周血和脾脏中均可检测到 ASC, ASC 数量均在第 9 天达到峰值, 时间早于首次免疫, 且在首次免疫和二次免疫中, 头肾组织的 ASC 数量均是 3 个组织中最高的。酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对首次免疫和二次免疫后血清中的抗体水平检测发现, 其变化趋势与 ASC 数量变化规律相同。研究结果表明, 尼罗罗非鱼在初次免疫后产生了免疫记忆, 在二次免疫过程中产生了更多的 ASC 和抗体, 头肾是 ASC 的主要来源组织。该结果可为鱼类的免疫记忆研究提供重要的科学依据。     

溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB的原核表达及条件优化和纯化

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白.结果表明:IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻孤菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为:0.2 mmol/L IPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol/L.这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础.     

鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交试验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾(K2HPO4)和氯化钙(CaCl2);确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1,CaCl20.2 g·L-1(单独灭菌),氯化钠(NaCl)5 g·L-1,pH 6.5±0.2。