新型不育胞质在栽培稻中的分布与鉴定

为了分析只含有不育基因orf216在栽培稻中的分布,鉴定具有新的细胞质雄性不育胞质类型的种质资源。选取栽培稻824个品系为研究对象,以细胞质雄性不育相关序列HL-Sp1的特异引物进行PCR扩增,初步筛选得到9个候选品系,利用细胞质雄性不育基因orf H79,orf216的特异引物进行PCR扩增完成进一步筛选,并用Southern杂交验证。结果表明,最终筛选出IR72892,IR43,IR73546 3个只含有不育基因orf216不含orf H79的新型细胞质雄性不育胞质类型的品系。通过分子标记辅助选择,已成功的从824个栽培稻种中筛选到新的具有细胞质雄性不育胞质类型的新品系,为后续不育系的培育和相关理论研究奠定基础。     

维管束发育相关基因sm-Nvas对水稻稻瘟病抗性分析

[目的]探究烟草维管束发育相关基因sm-Nvas对水稻稻瘟病的抗性。[方法]构建pCAMBIA1305.1-sm-Nvas双元表达载体,利用农杆菌介导的愈伤转化法转化水稻YTB,对转基因阳性植株接种稻瘟病菌后进行抗性观察。[结果]成功构建了pCAMBIA1305.1-sm-Nvas双元超表达载体,获得了转sm-Nvas YTB植株。离体接种稻瘟病菌后转基因植株的病斑比受体品种YTB的小。[结论]转sm-Nvas基因水稻具有稻瘟病抗性。     

鄂西南地区24个水稻品种稻瘟病发病比较

为比较24个水稻品种在鄂西南不同地区稻瘟病发病情况,筛选适合鄂西南种植的水稻品种,在2018、2019年分别在鄂西南10个地点（忠路、来凤、巴东、建始、长阳、鹤峰、宣恩、柏杨和咸丰,以武汉黄陂作对照）种植24个水稻品种,调查叶瘟和穗颈瘟发病情况。结果表明,2019年各地点的发病情况明显高于2018年,10个地点中发病最严重是宣恩,而咸丰2年都没有品种发生稻瘟病。在实验的24个品种中‘荣优华占’抗性最好,适合在鄂西南推广种植。     

水稻新型胞质不育系L-orfH79与其同核异质YTA的比较

[目的]验证新型细胞质不育系L-orfH79与其同核异质的近等基因系HL-CMS YTA的区别。[方法]用orfH79和orf290这2种分子标记对L-orfH79和YTA进行分子鉴定,并比较其花粉染色特性、花粉育性、结实率及orfH79表达量。[结果]分子标记鉴定结果显示L-orfH79只含有不育基因orfH79、不含有orf290,YTA同时含有orfH79和orf290。L-orfH79花粉的淀粉沉积比YTA更少,L-orfH79花粉大小均匀,而YTA的花粉形态不一。L-orfH79花粉育性、套袋结实率及自然结实率(都低于10%)略高于YTA(都低于5%)。当L-orfH79中引入恢复基因Rf5或者Rf6后花粉形态和颜色都恢复正常。抽穗期L-orfH79剑叶中的orfH79表达量低于YTA,在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后会减少orfH79的表达量。[结论]L-orfH79是不同于YTA的新型细胞质雄性不育系,L-Rf5、L-Rf6可作为其恢复系。     

额尔齐斯河与黑龙江流域哲罗鲑群体遗传差异比较

由于拦河筑坝、水体污染以及过度捕捞等原因,哲罗鲑(Hucho taimen)野生资源急剧衰退,已被列入中国脊椎动物红色名录,急需开展哲罗鲑野生群体的恢复与保护工作,人工增殖放流已成为最重要的保护方式之一。为了开展科学有效的哲罗鲑人工增殖放流工作,分析其不同来源群体的遗传多样性与遗传差异非常必要。通过测定来自我国额尔齐斯河(IR)、黑龙江(AR)以及人工繁殖(AP,亲本来源于黑龙江流域)的3个哲罗鲑群体线粒体DNA部分序列(COI和D-loop),并从GenBank下载来自俄罗斯鄂毕河(额尔齐斯河下游河流)、黑龙江流域的部分D-loop序列,比较额尔齐斯河与黑龙江流域哲罗鲑的遗传差异。结果表明,在测定的43尾个体中,线粒体DNA测序长度为2 626bp,共检测出37个多态位点,定义了18个单倍型,单倍型多样性为0.520～0.952,核苷酸多样性为0.00032～0.00167,其中IR群体的单倍型多样性最高,AR群体核苷酸多样性最高,而AP群体单倍型与核苷酸多样性均最低。分子方差分析(AMOVA)显示,77.19%的遗传变异来源于群体间,总遗传分化指数(Fst)为0.7719(P0.01),表明两个流域的哲罗鲑群体间存在显著的遗传分化。无论是仅使用本研究测定的样品,还是加入从GenBank下载的俄罗斯哲罗鲑样品,聚类分析结果均表明存在两个明显的单倍型谱系分支,额尔齐斯河流域哲罗鲑为单独一支,黑龙江流域哲罗鲑聚为另一支。建议加强人工繁殖哲罗鲑的遗传管理和不同水域哲罗鲑增殖放流的遗传学论证,有效维持自然水体哲罗鲑的遗传多样性水平。     

水稻HL-CMS细胞质雄性不育基因的体外转录及Northern Blot检测

[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,为Northern Blot检测提供阳性定量标准品,并可作为凝胶阻滞试验的底物,用于研究与恢复基因编码产物的相互作用,从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物,利用不育系YTA为材料,PCR扩增获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,补平粘性末端,以rN4为底物、用依赖于DNA的RNA聚合酶进行体外转录,转录产物用DNase处理除去DNA模板,纯化并测定RNA浓度,并用Northern Blot验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,经检测orf216浓度为1.286μg/μl,A260/A280为2.01;orfH79浓度为1.006μg/μl,A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一,纯度较高,可用于体外大量获取目的 RNA。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因表达载体的构建

[目的]构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[方法]利用长片段PCR在抗白叶枯病水稻品种扎昌龙中扩增长10.6 kb的候选基因,将其通过Asc I单酶切克隆至植物表达载体pCAMBIA1300中,并对阳性克隆进行质粒PCR、酶切检测和测序分析。[结果]试验成功构建了水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[结论]该研究为进一步研究Xa31(t)基因的功能奠定了基础。     

稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体p ENTR-sg RNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到p ENTR-sg RNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。     

稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因多位点编辑载体的构建

Pita2是定位于水稻第12号染色体着丝粒区域的稻瘟病广谱抗性基因,前期研究中通过精细定位得到了5个候选基因,其功能及作用原理还不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Pita2候选基因的多位点编辑载体。首先在候选基因外显子区域找到2个含有PAM序列的特异性靶位点序列,并构建候选基因入门载体SK-gRNA,然后利用同尾酶将SK-gRNA重组载体上的目的片段gRNA酶切,采用一步法将2个gRNA连接到双元表达载体p C1300-Cas9。质粒PCR鉴定以及测序的结果表明,以上5个多位点编辑载体构建成功。后期通过遗传转化并鉴定候选基因表达量与抗病性之间的关系,为水稻稻瘟病抗性基因Pita2功能研究奠定基础。     

水稻OsAAA1基因超表达载体构建及遗传转化

为了构建带Flag标签的OsAAA₁超表达载体,获得阳性转基因植株并分析其OsAAA₁基因表达情况。以日本晴的cDNA为模板,将OsAAA₁克隆至pU1301-Flag载体;重组质粒通过PCR、酶切及测序鉴定正确后,以农杆菌为介导进行遗传转化至日本晴;转基因植株通过分子鉴定正确后,采用Real-time PCR检测OsAAA₁基因的mRNA表达水平变化。成功构建了OsAAA₁-pU1301-Flag重组载体;遗传转化后获得33株转基因植株;通过分子鉴定筛选出26株阳性转基因植株;荧光定量PCR结果分析发现23株阳性转基因植株OsAAA₁基因的表达出现不同程度上调。与日本晴相比,有8株表达量达到30倍以上,其中有5株表达量超过40倍。成功构建了带Flag标签的OsAAA₁超表达载体;遗传转化结果表明OsAAA₁-Flag能整合到日本晴的基因组DNA中,从而使OsAAA₁基因的表达水平增加。本研究为后续通过Flag标签,在水稻植物体内直接挖掘与OsAAA₁互作的功能蛋白奠定了基础。