碱处理精子进行家兔ICSI介导转基因的初步研究

采用10 mmol/L NaOH碱处理家兔精子使精子破膜后,和外源基因共同孵育,然后通过ICSI技术导入卵母细胞。另设无碱处理无质粒孵育组和碱处理后精子无质粒孵育空白组,观察并比较胚胎的发育情况。结果:精子碱处理与质粒孵育对胚胎的发育无显著影响(P>0.05),ICSI介导转基因后观察囊胚出现绿色荧光,占总囊胚数的34.78%,外源性DNA的转入率为19.51%。试验初步建立了用碱处理精子结合家兔ICSI的转基因方法。     

山羊卵泡卵母细胞的采集与体外成熟研究

为了建立针对山羊卵母细胞的理想体外成熟培养体系,研究了山羊卵泡卵母细胞的采集方法和采集获得的可用卵母细胞的体外成熟培养条件,结果表明:切割法能够获得较多的可用卵母细胞,且明显增加了用于体外成熟的卵母细胞数;卵母细胞在37.0℃下培养的成熟率显著低于在38.5℃、39.0℃下培养的成熟率(P＜0.05);卵母细胞培养18 h和培养20h的成熟率极显著低于培养24 h和培养26 h的成熟率(P＜0.01);此外,卵母细胞体外成熟培养时,培养液中的胎牛血清添加量以10%～15%为宜.     

线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone对湖羊冻精损伤的保护作用

旨在研究线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone（MitoQ）对湖羊冷冻精子的保护作用。本研究选择健康的成年种公羊精液,将其分成6等份。不含MitoQ者设为对照组（M0）,M1、M2、M3、M4和M5组分别为含50、100、150、200和400 nmol·L^-1MitoQ的添加组。精子经冷冻解冻后检测活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性等精子质量指标,同时进行超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）等抗氧化指标检测。结果表明,当MitoQ添加的浓度为150 nmol·L^-1（M3组）时,其解冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高,分别达55.00%、52.34%、48.32%、54.51%和51.28%,其线粒体活性显著高于其他组（P<0.05）。M3组解冻后精子的SOD和GSH-Px值分别为203.90 U·mL^-1和123.62 U·L^-1,两者均显著高于M0、M1、M4和M5组（P<0.05）;M3组解冻后精子的ROS和MDA值分别为298.34 U·mL^-1和4.99 nmol·L^-1,显著低于其他组（P<0.05）。当MitoQ的添加浓度提高至200（M4组）和400 nmol·L^-1（M5组）时,冻精质量开始下降,并表现为对精子的氧化损伤。在湖羊冷冻精液中,添加150 nmol·L^-1的MitoQ可显著降低精子氧化损伤,提高冻精品质,当MitoQ的添加浓度超过200 nmol·L^-1时对冷冻精子没有保护作用。     

兔转基因成纤维细胞克隆的建立及条件优化

探索和优化兔成纤维细胞由单细胞成长为克隆群体的技术条件,建立转基因单克隆细胞系筛选系统,为进一步生产基因打靶克隆兔创造条件。将3～5代的成纤维细胞分散成单个细胞,对比不同培养基对单细胞克隆形成的影响。利用脂质体转染兔成纤维细胞后,按照不同的稀释比例传代并筛选转基因单细胞克隆,研究不同稀释比例对转基因单细胞克隆形成的影响。经过比较试验发现同化的DMEM/F12培养基能很好地支持单细胞克隆早期生长,转基因后1∶80倍的稀释比例能够获得较多的转基因单细胞克隆。本试验结果有助于提高转基因和基因打靶克隆动物的制作效率。     

山羊胚胎冷冻保存技术研究

本研究探讨了不同抗冻保护剂、不同冷冻方法、玻璃化液(EFS40)中添加FCS和BSA,以及冷冻前细胞松驰素B处理对山羊胚胎冷冻保存效果的影响。结果表明,山羊胚胎常规冷冻时以1.5 mol/L EG为抗冻保护剂的保护效果最好,解冻后胚胎发育率为70.59%,孵化率为58.82%;玻璃化冷冻细管法和OPS法以EFS40为保护液的冷冻效果较好,其解冻后胚胎的发育率分别为67.57%和52.94%;EFS40中添加BSA的冷冻保护效果显著地高于不添加其他成分的EFS40;山羊胚胎冷冻前用细胞松驰素B处理,能提高冷冻保存的效果。     

促性腺激素对山羊卵母细胞体外成熟的影响

为了建立针对山羊卵母细胞的理想体外成熟培养体系,本试验研究了在成熟培养液中添加不同浓度的促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体素(luteinizing hormone,LH),不同来源的FSH+LH对山羊卵母细胞体外培养成熟效果的影响。结果表明,采用TCM199添加10%FCS,1～2mg/L17β-E2,10mmol/LHepes,0.055mg/mL丙酮酸钠,2.2mg/mL NaHCO3,500μg/mL链霉素,500μg/mL青霉素,10mg/L FSH及20mg/LLH的培养体系,有利于山羊卵母细胞的体外成熟;进口的和国产FSH和LH对山羊卵母细胞成熟有相同促进效果。