H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73 pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。     

1株鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

从南京江浦某鸭场发病死亡的8日龄雏鸭肝脏中分离到1株病毒,该病毒耐氯仿,无血凝性,RT - PCR鉴定及序列分析结果表明,该分离病毒为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒.该毒株的病毒含量为107ELD50/0.1 mL,病毒回归鸭出现与临床发病鸭相同的症状,从攻毒死亡鸭体内分离到Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒.     

鹅细小病毒LH株的纯化及其生物学特性

取鹅细小病毒(GPV) LH株毒液,通过氯仿去除杂蛋白,用氯化钠与聚乙二醇-6000相结合方法粗提后,经蔗糖密度梯度离心纯化.通过PCR方法对不同浓度蔗糖溶液进行检测,取纯化毒液进行蛋白电泳及电镜观察,并无菌接种12日龄鹅胚,对死亡胚尿囊液进行PCR鉴定.试验结果显示:浓缩纯化后的GPV主要分布在50％～65％蔗糖浓度区间,病毒的蛋白含量为216 μg/L;电镜观察结果表明,病毒粒子分为实心和空心2种,直径大小在20～22nm;经SDS-PAGE电泳可看到多个条带,主要蛋白大小与病毒蛋白VP1、VP2和VP3相对应.纯化后的病毒接种敏感鹅胚仍可致其100％死亡,死亡胚具有特征性的病变,尿囊液经PCR鉴定,呈GPV核酸阳性.本试验所用方法获得的纯化GPV病毒液的纯度高且保持了该病毒的毒力特性,是一种方便可行的纯化该病毒的方法.     

不同浓度格利特消毒剂对鸡粪中H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果观察

为验证在有机物存在下格利特(20％戊二醛溶液)消毒剂杀灭禽流感病毒的能力,试验模拟空栏鸡舍和周围环境消毒实际情况,在鸡粪中混入H9亚型禽流感病毒,以接种鸡胚尿囊液中H9亚型禽流感病毒血凝价＜2 log2判为感染阴性,以样品经消毒剂作用后检测不到病毒含量(即0EID50)为病毒完全杀灭(100％杀灭病毒),研究格利特消毒剂杀灭禽流感病毒的效果,结果显示:1∶400以下稀释的格利特消毒剂4℃或25℃作用20 min,均能100％杀灭混入鸡粪中的H9N2禽流感病毒;1∶200稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,能100％杀灭存在于鸡粪和清洁剂中的H9N2禽流感病毒.1∶1600以下稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,均能100％杀灭无鸡粪保护的H9N2禽流感病毒.     

鹅副粘病毒HN蛋白的原核表达与免疫学鉴定

以GenBank登录的鹅源副粘病毒GPMV ZJI株基因组全序列为模板,在HN基因开放阅读框上下游设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到HN基因,将目的基因克隆至pET32a表达载体上,转化至BL21中,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达。由结果可知,通过RT-PCR法扩增出HN基因,大小与预期一致。SDS-PAGE和Western-blot均得到预期条带,说明pET32a表达载体在BL21中成功表达了HN蛋白,为后续相关免疫学研究奠定基础。     

新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究

【目的】证实新型黄病毒在种鹅中是否存在垂直传播,为控制该病提供可靠的流行病学依据。【方法】采用巢式RT-PCR和病毒分离技术,对患病种鹅病料、不同孵化阶段死胚、出雏蛋壳内部冲洗液、弱雏样品进行黄病毒分离及基因检测。【结果】在患病种鹅、孵化过程中死亡鹅胚尿囊液、出雏蛋壳内壁洗液和雏鹅中均能检测和分离到黄病毒,其中患病种鹅病料的黄病毒阳性率为100.0%,孵化死亡鹅胚黄病毒阳性率为39.6%,出雏蛋壳内部冲洗液黄病毒阳性率为45.0%;1日龄和15日龄弱雏黄病毒阳性率为80.0%。【结论】黄病毒可以通过鹅胚传到下一代,即新型黄病毒在种鹅中存在垂直传播的现象。     

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。     

鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70)。含重组质粒pET32aHSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。     

鸭疫里氏杆菌RA JS01菌株的PCR鉴定及生物学特性

在临床疑似鸭传染性浆膜炎的病鸭组织中分离了1株RA JS01菌株,通过形态观察、生化试验和PCR鉴定,确定该菌株为鸭疫里氏杆菌,结果表明:该菌株对多数抗生素都具有耐药性和较强的致病性;经静脉和足底接种的鸭在接种后24 h时开始死亡,接种96 h时全部死亡;连续传至22代时菌株的生物学特性均未发生变化。     

检测坦布苏病毒病抗体NS1-ELISA方法的建立与初步应用

为建立快速检测鸭坦布苏病毒病抗体的血清学方法,本研究利用鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列将其克隆至原核表达载体pET32a上,建立重组表达pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中。经IPTG诱导得到NS1融合蛋白,融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性,纯化的坦布苏病毒NS1蛋白作为包被抗原,在最佳检测条件基础上,建立了检测坦布苏病毒病(Tembusu virus disease,简称TVD)抗体的间接ELISA方法。结果在条件优化后抗原最适包被量为1.925μg·孔-1,抗原最佳包被条件为37℃放置1 h后4℃过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,最佳封闭时间为1 h,酶标二抗最适稀释度为1∶1 000,显色时间10 min。阴阳性临界值判定标准为0.346。用建立的间接ELISA方法检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎、TVD阳性血清样品均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。板内和板间重复试验的最大变异系数分别为6.7%和8.2%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接NS1-ELISA方法对81份疑似鸭坦布苏病毒病血清样品进行检测,有43份样品呈现阳性,E-ELISA有48份呈阳性结果,证明该方法具有较高的敏感性。NS1-ELISA方法的建立为TVB的诊断和流行病学调查提供了一种新的方法。