牙鲆胚胎低温处理下内参基因筛选及CIRP和Hsp70基因表达分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国主要的海水经济养殖鱼类,在胚胎冷冻保存方面已获得了超低温冷冻保存成功的案例,但在分子水平上对牙鲆胚胎在低温状态下相关基因的表达进行研究,至今还未见报导。本研究首先收集了牙鲆的3个胚胎时期(肌节期、尾芽期和心跳期),分别在0℃及16.5℃进行处理培养,使用实时荧光定量PCR技术检测4个内参基因18S rRNA、ACTB、GAPDH及EF1α的表达水平,并用Ge Norm和Norm Finder软件对其的稳定性进行排序分析。Ge Norm软件分析结果显示,18S rRNA和EF1α的稳定性最好,稳定性最差的为GAPDH;Norm Finder软件分析结果显示,18S rRNA的稳定性最好。综合两个软件的分析结果,在不同发育时期以及低温处理的牙鲆胚胎中,18S rRNA表达量相对稳定,较其他3个基因更适合作为内参基因。为探究牙鲆胚胎在低温处理下分子水平的变化,本研究选取了对温度适应性较强的尾芽期胚胎为实验材料,分别在低温0℃和正常培养温度16.5℃下进行培养,并选取与应激反应相关的热休克蛋白基因(heat shock protein,Hsp)70和冷诱导RNA结合蛋白基因(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)进行表达量分析。实时荧光定量PCR的结果表明,CIRP的表达量在0℃处理30 min之内逐渐下降,在30 min时达到最低值,30~120 min内上升,并在120 min时达到峰值,之后回落,在180 min时,其表达量回落到与对照组相似的水平。而Hsp70在低温处理的前30分钟表达量下降,后回升,120 min达到最大值后回落的现象,与对照组有显著性差异(P0.05)。研究结果说明低温会导致CIRP及Hsp70基因表达水平的改变,先下降后升高再回落的趋势也说明了机体内对低温应激产生了保护反应,为探索牙鲆胚胎在低温下调节和适应的分子机理提供了一定的依据。     

海藻糖对施氏鲟精子冷冻保存效果的影响及其冷冻损伤机理的初步探究

为了解抗冻剂对施氏鲟(Acipenser schrenckii)精子冷冻保存效果的影响及其冷冻损伤机理，比较了添加不同浓度海藻糖和蔗糖作为冷冻保护剂的精子稀释液处理后施氏鲟精子冷冻复苏的活力、快速运动时间和寿命。结果表明，添加60 mmol·L^-1海藻糖1.0 mmol·L^-1氯化钾的稀释液处理后，精子冻后快速运动时间和寿命与鲜精相比无显著差异(P>0.05);且活力较其他处理组有所提高，达到(26.67±3.32)%,但仍显著低于鲜精(P<0.05)。利用透射电镜和扫描电镜对施氏鲟精子超低温冷冻保存前后的超微结构进行观察，并对其能量代谢酶和抗氧化酶活进行测定和比较，结果表明，低温冻存造成施氏鲟精子的膜系统和细胞器(主要为线粒体和轴丝)损伤；能量代谢酶[总ATP酶、肌酸激酶(CK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)]和抗氧化酶[过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)]活性均显著下降(P<0.05),而抗氧化酶谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著上升(P<0.05),表明...