AFLP技术及其在植物和病原真菌研究中的应用

综述了AFLP分子标记技术的基本原理、方法及其在植物和病原真菌研究中的应用现状,并探讨了其中存在的一些问题。     

干旱胁迫下斑茅消减文库的构建及分析

以干旱胁迫下斑茅(Saccharum arundinaceum Retz.)叶片组织的cDNA为Tester，正常生长条件下斑茅叶片组织cDNA为Driver，利用抑制性消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）构建斑茅干旱胁迫消减文库。文库克隆总量约为30 000个，克隆重组率为99.2%；随机从文库中挑取3500个克隆分析表明，插入片断长度主要集中在200~1 000 bp之间，500 bp以上的有463个克隆，500 bp以下的有3 037个克隆，平均长度约450 bp; 通过随机对16个文库阳性克隆的测序及分析，3个克隆与ATP-NAD kinase、Aldo/keto reductase和锌指蛋白高度同源，3个克隆没有同源性，10个与逆境相关，是功能未知的EST。选择编号为EL0149和EL0145两个克隆进行Northern杂交验证，结果表明EL0149克隆为干旱胁迫上调表达的EST序列，而EL0145在正常供水和干旱条件下均无明显的的杂交信号。说明本研究克隆的SSH文库质量较高，可以进一步利用SSH文库结合芯片表达谱分析解析作物水分胁迫下的相关抗旱基因网络。     

利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系.利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库.综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5x106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%.本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础.     

甘蔗锌指蛋白基因的克隆和表达分析

在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,获得1个编码锌指蛋白基因的全长cDNA序列,命名为Sc-zf.生物信息学分析表明,该基因全长1 189 bp,编码171个氨基酸,具有zf-A20和zf-AN1两个锌指结构域;构建了包含Sc-zf开放读码框的原核表达载体,经IPTG诱导,目的基因原核表达产物大小约为18.3 kD;经定量PCR技术分析,该基因在黑穗病菌(Ustilago scitaminea)、水杨酸(SA)、H2O2、NaCl和PEG胁迫下表达特性不同,受到黑穗病菌和NaCl的诱导,PEG的抑制,但也受SA和H2O2的影响.     

水分胁迫下斑茅3个逆境代谢相关基因表达的实时PCR分析

【研究目的】初步探讨斑茅3个关键逆境适应相关基因在水分胁迫下的表达机制。【方法】已克隆S-腺苷蛋氨酸脱羧酶、鸟氨酸氨基转移酶、甜菜碱脱氢酶3个基因和内参基因的基础上,应用定量PCR技术,对这3个基因在不同胁迫时间下的表达水平进行分析。【结果】斑茅的S-腺苷蛋氨酸脱羧酶、鸟氨酸氨基转移酶基因、甜菜碱脱氢酶基因表达在初期均受抑制,后期表达持续上调,但甜菜碱脱氢酶基因受水分诱导表达较前两个基因明显。【结论】这可能暗示着在斑茅中,脯胺酸和甜菜碱的合成受水分胁迫诱导,而甜菜碱的合成相对脯胺酸和多胺受水分胁迫诱导影响更大。这些研究为斑茅抗旱的分子机制提供初步的理论基础。     

植物致病镰刀菌的研究进展

从植物镰刀菌病原菌的检测鉴定和多样性,病原的侵染及其与寄主植物的互作,致病基因的分析与进化,毒素的形成和甘蔗镰刀菌病害的研究现状等几个方面加以综述,并为未来的研究提供重点和思路。     

甘蔗R2R3-MYB类似基因Sc2RMyb1的克隆及表达特性分析

R2R3-MYB是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。为获得甘蔗(Saccharum complex)R2R3-MYB转录因子基因序列信息及其在不同非生物因子胁迫下的表达情况,本研究通过对甘蔗EST数据的分析,运用电子克隆获得一个甘蔗R2R3-MYB类似基因序列,进而采用PCR方法从甘蔗中克隆了该基因的基因组DNA和cDNA序列,基因命名为Sc2RMyb1(GenBank序列号:JQ823165)。Sc2RMyb1的基因组DNA全长1807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli),经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kD。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl抑制而下调,推测该基因作为负调节因子参与了NaCl胁迫应答相关基因的调控过程。本研究结果为后续该类转录因子基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用提供了基础资料。     

基于蔗糖代谢基因多态性的甘蔗基因型遗传多样性

[目的]探讨利用基于蔗糖代谢酶基因多态性的目标区域扩增多态性(target region amplificationpolymorphism,TRAP)标记进行甘蔗遗传多样性、遗传距离及遗传距离与糖分表型值关联性分析的可行性.[方法]利用4个根据参与蔗糖代谢酶基因SuSy、SPS,SAI和PPDK设计的锚定引物和9个随机引物,筛选具有多态性的17对引物组合,对28个糖分性状表型不同的甘蔗基因型进行TRAP标记,通过分子标记数据,估算不同基因型蔗糖代谢基因的遗传变异和遗传距离,并进行聚类分析.[结果]共扩增出170个条带,其中109个为多态性条带,多态性比率为64.1%,平均每个引物组合产生10个条带,6.4个多态性条带.在所测试的28个甘蔗基因型中,基于蔗糖代谢酶基因多态性所估计的遗传相异系数(genetic dissimilarity,GD)为0.12-O.80.基于GD的UPGMA聚类结果显示,在GD=O.49处,供试基因型可被划分为4类,但就所采集的特定时期的锤度数据而言,类间和类内的锤度表型值没有明显的规律.[结论]甘蔗不同基因型间4个蔗糖代谢酶基因遗传变异较高,多态性丰富,暗示TRAP技术在评价甘蔗蔗糖分性状方面具有应用潜力,但与锤度表型值数据的关联性还有待进一步 研究.     

利用斑茅cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达

为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制,利用斑茅干旱胁迫cDNA芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达。经杂交,在cDNA芯片的3 860个模板中,有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为101个,其中上调55个,下调46个。部分基因的定量PCR验证表明,芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除,一共获得36个unique ESTs。已知功能的22个上调表达基因,涉及多条生理代谢途径,如光合作用、离子转运和核酸代谢途径;以及多种分子水平的进程,如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外,还检测到14个未知功能基因。结果表明,甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达及其网络构建奠定了基础,还可以为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。