次氯酸消毒液对猪源病原体的消杀效果

为评价次氯酸消毒液(以下简称消毒液)对猪源病原体的消杀作用,以猪场常见的5种病原菌和5种病毒为研究对象,测试消毒液在不同浓度和不同作用时间下的消杀效果.悬液定量杀菌试验结果表明,消毒液原液(次氯酸含量为210 mg/L)和1:2倍稀释消毒液(次氯酸含量为105 mg/L),作用30 s即可杀灭猪链球菌2型(SS2)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪丹毒杆菌(ER)和猪大肠杆菌(ETEC);1:4倍稀释消毒液(次氯酸含量为52.5 mg/L)作用1 min能杀灭HPS、ER和ETEC,作用5 min能杀灭SS2和APP,杀灭对数值均>7.00,杀灭率均为100％.病毒灭活试验结果表明,消毒液原液作用1 min对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)的平均灭活对数值均≥5.00,杀灭率均≥99.999％;1:2倍稀释消毒液作用1 min对PEDV的平均灭活对数值为4.00、杀灭率为99.990％;消毒液原液作用5 min和10 min,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的杀灭率为99.899％,对猪伪狂犬病病毒(PRV)的杀灭率为92.921％,对猪圆环病毒2型(PCV2)的杀灭率为90.00％.表明次氯酸消毒液在推荐浓度下对猪场常见病原菌有快速高效的消杀效果,对PEDV和PPV等病毒亦有良好的消杀作用.     

西藏牦牛牛支原体的分离鉴定及其生长特性、耐药性分析

为确定引起西藏牦牛常发多发肺炎的细菌病原体，采集145份西藏牦牛鼻腔粘液，通过病原分离培养、菌落形态观察、生化试验和PCR鉴定等方法进行细菌检测；通过OD₆₃₀和pH变化对分离株进行生长曲线测定；采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。结果显示:从145份牦牛鼻腔粘液中分离得到10株牛支原体；分离株菌落形态和生化试验结果均符合牛支原体的生物学特性；通过PCR分别扩增得到238 bp的uvrC特异性基因与1 500 bp 16S rRNA基因。10株分离株间的uvrC特异性基因和16S rRNA基因序列同源性较高，均与国际标准株PG45有高度同源性，uvrC特异性基因序列和16S rRNA基因序列与国际标准株PG45的同源性分别为98.4%~100%和99.1%~99.9%。生长曲线测定表明，分离株在PPLO培养基中培养24 h内为迟缓期，培养42 h后开始进入稳定期，78 h后开始进入衰亡期；3个分离株培养物的平均pH随着培养时间延长不断降低，其中24~42 h期间pH下降最快，随后下降速度减慢，至78 h后几乎不再变化。药物敏感性试验表明，分离株对大环内酯类、氨基糖苷类和林可胺类等药物均存在不同程度的耐药，但对强力霉素和卡那霉素敏感或中度敏感。     

藏猪产色葡萄球菌分离鉴定及生物学特性研究

为了解西藏林芝市健康藏猪的葡萄球菌感染情况，对从西藏林芝市工布江达县巴河镇屠宰场、林芝市巴宜区西藏农牧学院教学实习牧场、林芝市巴宜区屠宰场采集的232份样品进行了细菌分离培养与鉴定，并对1株分离菌株进行了较为系统的生物学特性研究。流行病学调查结果显示，在232份样品中，共检出73份葡萄球菌阳性，阳性率为31.47%，其中在西藏林芝工布江达县巴河镇屠宰场检出16份阳性，检出率为23.89%（16/67）；林芝市巴宜区西藏农牧学院牧场检出43份阳性，检出率为34.40%（43/125）；林芝市巴宜区屠宰场检出14份阳性，检出率为35.00%（14/40）；分离菌经PCR鉴定、基因测序、生化鉴定，证明分离到5株产色葡萄球菌，对其中一株（Sa LZ1）进行了系统的研究。Sa LZ1菌株在琼脂培养基上形成圆形凸起、边缘整齐、表面光滑、不透明的瓷白色菌落，革兰氏染色为阳性球菌；PCR测序结果显示，分离株与产色葡萄球菌（GenBank登录号：MG576253.1）同源性最高；生化鉴定结果显示，其对血清菊糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖等表现为阳性，对阿拉伯糖、马尿酸钠、棉子糖、木糖、尿素等表现为阴性，符合产色葡萄球菌的生化特性；Sa LZ1在接种后5~10 h处于对数生长期；小鼠致病性试验显示，当Sa LZ1菌株攻毒浓度达3.5×10⁹ CFU/mL时小鼠死亡率达100%，且病理切片结果表明，Sa LZ1菌株能引起小鼠内脏组织发生病变。以上结果为西藏林芝市藏猪葡萄球菌的防控提供理论依据。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及4种检测试剂盒的比较

为评估目前常用商品化非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒,参考OIE推荐的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR方法合成引物和探针,建立非洲猪瘟病毒qPCR检测方法(OIE-qPCR);并与市面4种ASFV检测试剂盒进行了比较.以人工合成的ASFV p72基因TA克隆重组质粒为阳性标准品,OIE-qPCR可以检测到10～102 copies;而4种ASFV荧光定量PCR检测试剂盒中,进口试剂盒TF-qPCR能检测到10 copies,进口试剂盒ID-qPCR和国产试剂盒QD-qPCR能检测到10～102 copies,而国产试剂盒LY-qPCR能检测到102 copies.对健康猪组织样及临床模拟样品的检测结果显示:OIE-qPCR与4种检测试剂盒之间的符合率为92.60％～99.03％.其中,阳性样品CT值的相关系数为0.988～0.997(Perason法),表明各试剂盒之间相关性良好;但在检测病毒核酸含量较低的样品时,各试剂盒结果之间存在一定差异,其中,TF-qPCR试剂盒显示更高的阳性检出率,ID-qPCR试剂盒和LY-qPCR试剂盒次之.本研究为临床选用非洲猪瘟病毒快速检测试剂盒提供了依据.     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用

为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型（PCV-2）与猪圆环病毒3型（PCV-3）,并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体系后进行特异性和灵敏性的测定,并对西藏林芝周边地区藏猪粪便进行检测。结果显示,建立的PCV-2和PCV-3双重PCR检测方法对PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PEDV等常见猪源病原的检测结果均为阴性;并且建立的PCV-2和PCV-3双重PCR的灵敏度与PCV-2和PCV-3单一PCR的灵敏度一致,均能达到10¹拷贝数/μL;利用建立好的双重PCR方法对西藏藏猪临床样品进行检测,PCV-2、PCV-3的阳性率分别为38.3%（18/47）、12.8%（6/47）,混合感染率为10.6%（5/47）,与单一PCR的符合度为100%。由此可见,本研究建立的PCR方法方便、特异、准确,并有很高的敏感度,适于临床样品的检测,为PCV-2与PCV-3的诊断和防控提供理论依据。     

西藏部分地区羊棘球蚴感染情况调查及影响因素分析

为调查西藏部分地区羊棘球蚴感染情况并分析其感染的危险因素，本研究利用剖检法和PCR法对西藏部分地区的281只羊的各组织样品进行羊棘球蚴检测，通过SPSS 27软件对281只羊组织样品的检测结果进行卡方检验分析，将有统计学意义(P<0.1)的因素建立二元Logistic回归模型，分析羊棘球蚴感染的危险因素，并以优势比(OR值)判定这些因素引发感染的危险性。结果显示，本次调查区域内羊棘球蚴均为细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)，其感染率为37.01%(104/281)，其中仲巴县感染率最高，达62.26%(66/106)，其中4个县区感染率均在20%～30%。年龄差异和海拔因素与羊棘球蚴感染率均呈正相关，不同采样地点和不同羊的(绵羊、山羊)棘球蚴感染率均差异显著，不同采样时间羊感染率差异不显著。其中，羊年龄差异是西藏部分地区棘球蚴感染的危险因素。应当针对危险因素进行合理干预，以降低感染风险。本研究对西藏部分地区羊棘球蚴感染情况进行调查研究，为家畜包虫病的防治提供参考。