甘蔗热带种金属硫蛋白家族基因的克隆及响应重金属胁迫的表达分析

金属硫蛋白是一类富含巯基的低分子量蛋白,在植物的重金属解毒及细胞氧化还原调控等方面起重要的作用。本研究以甘蔗热带种Badila组培苗为材料,分别测定了其在CdCl2、ZnSO4和CuCl2水溶液培养条件下地上部和地下部的重金属含量,结果显示其对上述3种重金属有较强的耐受与富集能力。继而克隆了ScMT1(登录号为KJ504373)、ScMT2-1-5(登录号为MH191346)和ScMT3(登录号为KJ5043704)3个金属硫蛋白家族基因,它们分别属于植物MT亚家族中的MT1、MT2和MT3型基因。ScMT1含有1个内含子和2个外显子,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长228 bp,编码75个氨基酸;ScMT2-1-5含有2个内含子和3个外显子,ORF长246 bp,编码81个氨基酸;ScMT3含有1个内含子和2个外显子,ORF长198 bp,编码65个氨基酸。RT-qPCR显示,Cd2+胁迫下,在甘蔗地上部和地下部,ScMT2-1-5均连续显著上调表达,而ScMT1的上调应答出现延迟。ScMT3在地上部的上调应答出现延迟,在地下部呈“扬-抑”趋势,提示甘蔗响应Cd^2+胁迫过程中ScMT2-1-5起更积极的作用,ScMT1参与胁迫后期的分子响应,而ScMT3不起主导作用。Cu^2+胁迫下,地上部ScMT1连续显著上调表达,ScMT2-1-5和ScMT3呈总体上调的表达趋势;地下部,ScMT1和ScMT2-1-5的上调表答均出现延迟,仅在胁迫后期显著上调表达,而ScMT3仅在胁迫前期显著上调表达。该结果提示了ScMT1、ScMT2-1-5和ScMT3在Cu2+胁迫响应过程中的协作关系,三者共同参与了地上部的胁迫响应,其中ScMT1起更积极的作用;此外三者还先后参与了地下部对Cu^2+胁迫的分子响应。Zn^2+胁迫下,ScMT1和ScMT3分别仅在地上部和地下部显著上调表达;ScMT2-1-5在地上部和地下部均呈“扬-抑”的应答趋势;提示了在甘蔗响应Cd^2+胁迫应答过程中ScMT1和ScMT3分别在地上部和地下部起主要作用,ScMT2-1-5参与了胁迫前期的分子响应。ScMT1、ScMT2-1-5和ScMT3在甘蔗不同组织中及在重金属(Cd^2+、Zn^2+或Cu^2+)不同累积水平下呈现出相似或互补的应答特性,提示上述甘蔗MT家族不同成员在重金属解毒及细胞氧化还原调控等方面产生了功能分化,且三者在应对过量Cd^2+、Zn^2+或Cu^2+对甘蔗组织造成伤害的过程中存在时空上的协同作用。该研究为深入理解多倍体植物甘蔗中MT家族各成员基因在重金属耐受过程中的协同作用机制奠定了基础。     

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。     

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1的克隆与表达分析

以甘蔗(Saccharum spp.hybrid)抗黑穗病基因型崖城05-179为材料,采用同源克隆法获得了1个几丁质酶基因全长cDNA序列(GenBank登录号为KF279661),命名为ScChiⅦ1,序列长907 bp,编码299个氨基酸,属于糖苷水解酶第19家族,预测为胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚类分析显示,该基因与其他植物ClassⅦ几丁质酶基因聚为一类。基因组序列(GenBank登录号为KF279662)分析显示,该基因含有2个长度分别为615 bp和86 bp的内含子。实时荧光定量分析结果表明,甘蔗黑穗病菌胁迫下,ScChiⅦ1在抗病(崖城05-179)和感病基因型(柳城03-182)中差异表达,推测ScChiⅦ1可能参与黑穗病菌胁迫的防御反应。组织特异性表达分析结果显示,ScChiⅦ1在甘蔗叶、芽、皮、肉、根中均有表达,但在芽中表达量最高,推测与该病原从蔗芽侵入有关。研究结果为进一步研究甘蔗几丁质酶基因功能及甘蔗与黑穗病菌互作机制提供了有益的信息。     

基于蔗糖代谢基因多态性的甘蔗基因型遗传多样性

[目的]探讨利用基于蔗糖代谢酶基因多态性的目标区域扩增多态性(target region amplificationpolymorphism,TRAP)标记进行甘蔗遗传多样性、遗传距离及遗传距离与糖分表型值关联性分析的可行性.[方法]利用4个根据参与蔗糖代谢酶基因SuSy、SPS,SAI和PPDK设计的锚定引物和9个随机引物,筛选具有多态性的17对引物组合,对28个糖分性状表型不同的甘蔗基因型进行TRAP标记,通过分子标记数据,估算不同基因型蔗糖代谢基因的遗传变异和遗传距离,并进行聚类分析.[结果]共扩增出170个条带,其中109个为多态性条带,多态性比率为64.1%,平均每个引物组合产生10个条带,6.4个多态性条带.在所测试的28个甘蔗基因型中,基于蔗糖代谢酶基因多态性所估计的遗传相异系数(genetic dissimilarity,GD)为0.12-O.80.基于GD的UPGMA聚类结果显示,在GD=O.49处,供试基因型可被划分为4类,但就所采集的特定时期的锤度数据而言,类间和类内的锤度表型值没有明显的规律.[结论]甘蔗不同基因型间4个蔗糖代谢酶基因遗传变异较高,多态性丰富,暗示TRAP技术在评价甘蔗蔗糖分性状方面具有应用潜力,但与锤度表型值数据的关联性还有待进一步 研究.     

利用斑茅cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达

为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制,利用斑茅干旱胁迫cDNA芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达。经杂交,在cDNA芯片的3 860个模板中,有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为101个,其中上调55个,下调46个。部分基因的定量PCR验证表明,芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除,一共获得36个unique ESTs。已知功能的22个上调表达基因,涉及多条生理代谢途径,如光合作用、离子转运和核酸代谢途径;以及多种分子水平的进程,如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外,还检测到14个未知功能基因。结果表明,甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达及其网络构建奠定了基础,还可以为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。     

甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择

以甘蔗接种黑穗病菌后0、6、12、24、48、60和72 h时间点的材料为研究对象,应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR Real-time qPCR)技术,探讨25S rRNA、GAPDH、β-actin和β-tubulin4个内参基因mRNA水平的表达情况.经geNorm程序统计学分析,4种内参基因的表达稳定性各异,25S rRNA>GAPDH>β-actin>-tubulin,其中以25S rRNA表达稳定性最好,且根据该基因设计的两对定量PCR引物都是可行的.同时,甘蔗PPO基因表达特性的定量PCR分析也显示,甘蔗PPO基因与植物的抗病性相关.结果显示,研究中所筛选的内参基因是合适的.     

宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法建立

利用宿根矮化病菌的特异检测引物,构建竞争定量PCR检测的非同源模板,建立宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法.实验中非同源模板(竞争模板)构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严谨度扩增,回收合适的DNA片段并将其构建到T-esay载体上,通过测序和序列比对,除两端引物序列完全相似外,其余部分没有同源性,因此可以作为定量检测的非同源模板.通过计算非同源模板的拷贝数,进行竞争定量PCR检测宿根矮化病,建立宿根矮化病菌的标准竞争曲线和直线回归方程.本研究建立的竞争定量PCR检测方法操作简单、特异性和敏感性高,适合于宿根矮化病菌的检测,并可为其它病菌竞争定量PCR检测方法的建立提供参考.     

甘蔗EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库获得262 113条甘蔗EST,通过前处理和聚类拼接得到全长为50 058.89 kb的无冗余Unigene 62 565条。在这些序列中搜索出9 482个SSRs,出现频率是15.15%;平均5.28 kb出现1个SSR。三核苷酸重复是主要的类型,占总SSRs的45.92%。CT和CGC是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复的21.22%和8.18%。此外还对筛选出的SSR进行多态性预测,得到了长度在20 bp以上的低级基元一、二、三核苷酸EST-SSR共1 405条,占长度20 bp以上的SSR总数的59.16%。结果为甘蔗EST-SSR标记的开发和相关分子生物学研究提供资料和奠定基础。     

基因枪法将LEAFY基因导入甘蔗的研究

利用基因枪介导的方法,以LEAFY基因为目的基因,NPTⅡ为选择/标记基因进行共转化.对影响基因枪法转化甘蔗的影响因素进行了探讨,结果表明转化前预培养2 d获得的转化效率最高,转化前后进行高渗处理可以提高转化效率.大量转化后,将LEAFY基因导入到3个甘蔗品种Badila、ROC22和ROC16中去,获得了转LEAFY基因的甘蔗植株.其中抗性愈伤     

应用AMMI和HA-GGE双标图分析甘蔗品种产量 稳定性和试点代表性

对甘蔗区域试验数据进行基因型与环境互作分析,有利于全面了解参试品种的丰产性和各试点的代表性,对优良新品种的推广和品种的区域分布也有着重要意义。本文综合利用AMMI模型和HA-GGE双标图对2014年国家甘蔗第10轮区域试验11个品种和13个试点的蔗茎产量和蔗糖产量数据进行产量稳定性和丰产性分析,评价试点的代表性和分辨力。结果表明:蔗茎产量和蔗糖产量在不同品种和试点间存在极显著差异,品种和试点存在极显著互作效应。‘福农40号’综合表现最佳,是产量高、丰产性好且蔗茎产量和蔗糖产量的稳定性均较强的品种;‘云蔗08-2060’的产量略低于‘福农40号’,但蔗茎产量和蔗糖产量的稳定性强于‘福农40号’;与对照品种‘ROC22’相比,‘粤甘43号’、‘粤甘46号’和‘闽糖02-205’的蔗茎产量和蔗糖产量较高,稳定性中等,‘福农40号’、‘粤甘43号’、‘粤甘46号’和‘云蔗08-2060’均具有较强的适应性,可在适宜蔗区推广应用。综合AMMI和HA-GGE双标图分析结果表明,广东遂溪、云南开远和福建福州具有较高的地点分辨力和试点代表性。因此,AMMI和HA-GGE双标图的综合运用,可更准确直观地评价出各品种的丰产性、稳定性和适应性以及各试点的分辨力和代表性。本研究可为甘蔗新品种的鉴定与推广提供有价值的理论参考。