团头鲂MHCⅡ α基因的SNP位点开发、鉴定及与抗病性状关联分析

用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染团头鲂(Megalobrama amblycephala)区分抗病和易感组,通过PCR扩增及测序在MHCⅡα基因上筛选单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNP),利用高分辨率熔解曲线法和限制性内切酶酶切法对SNP进行分型,分析其多态性及与抗病性状之间的关系。在MHCⅡa基因上共筛选出35个候选SNP位点,占MHCⅡa基因总碱基的1.45%,包含30个转换位点、5个颠换位点。其中外显子部分有16个,内含子部分7个,5′非编码区有1个,3′非编码区有11个。有13个SNP位点位于编码区,占总氨基酸位点的5.56%,位于839bp的T/A颠换和1 663bp的A/G转换是无义突变,其余11个SNP位点为有义突变。α1结构域的SNP位点分别占总碱基和总氨基酸位点的4.88%和10.98%,明显高于α2结构域的1.08%和3.22%。MHCⅡα基因的21个抗原结合位点(peptide binding region,PBR)中,有4个位点变异,变异率为19.05%;而non-PBR的变异率仅为8.20%(5/61)。用SPSS软件对分型成功的5个SNP位点在易感和抗病组各100尾中的基因型频率和等位基因频率进行了统计。通过卡方检验分析发现位于1 395bp(T/A)位点的基因型频率和等位基因频率在易感和抗病组中差异极显著,位于221bp(G/T)和1 859bp(G/T)位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗病组中差异显著。本研究结果表明团头鲂MHCⅡα基因的多态性和抗细菌性败血症性状显著关联。     

草鱼MHC I区基因的表达特征

为全面了解草鱼MHC I区基因及其表达特征,利用已知斑马鱼MHC I区基因序列,通过本地Blast得到草鱼MHC I区的部分基因序列。采用RT-PCR技术,检测MHC I区BRD2、KNSL2、RXRB、TAPBP、FABGL、MHC Ia、PSMB9以及TAP2等8个基因在健康草鱼各组织的表达水平。结果表明,除FABGL在肾脏表达量最高外,其他基因都在血液中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR检测草鱼在嗜水气单孢菌感染后4、12、24、48及96h,MHC I区免疫相关基因在脾脏和肾脏中的表达情况。结果发现,BRD2表达量分别在12h和24h在肾脏和脾脏中达到最高;MHC Ia表达量在脾脏和肾脏中都先上升后下降,并都在24h达最大值;PSMB9表达量在脾脏先上升后下降,在12h达最大值,在肾脏中则先下降后上升,在24h达最大值;TAP2在脾脏和肾脏中整体呈先下降后上升的趋势,在24h都达最大值,并最后都回调至正常范围。BRD2、MHC Ia、PSMB9、TAP2的表达量在攻毒后都有显著性变化,表明这4个基因在草鱼免疫方面具有重要的作用。