水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(RsPhm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,RsPhm基因的DNA和cDNA全长序列分别为2628 bp和1983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,RsPhm基因在立枯丝核菌(R. solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过qRT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌RsPhm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高RsPhm基因的表达量,在12.5 µg/mL浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25 µg/mL和50 µg/mL浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100 µg/mL浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了RsPhm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌RsPhm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

水稻纹枯病菌RsCat基因的克隆及其表达分析

为阐明水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)过氧化氢酶基因(RsCat)的功能,采用常规PCR和RT-PCR技术克隆得到RsCat基因。生物信息学分析表明,RsCat基因DNA和cDNA的全长序列分别为1814bp和1 395bp,开放阅读框(ORF)编码464个氨基酸。保守结构域分析显示,RsCat蛋白具有过氧化氢酶超家族结构域和过氧化氢酶相关免疫反应结构域。系统进化分析显示:水稻纹枯病菌不同融合群的RsCat基因具有较高的序列同源性。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明:RsCat基因的表达受儿茶酚的诱导,随着儿茶酚质量浓度增大,表达量上调,而随着儿茶酚质量浓度增大,CAT活性降低。说明RsCat基因的转录表达和CAT酶活不存在对应性。推测RsCat基因可能存在转录后或表达产物翻译后修饰。     

儿茶酚和莨菪碱对水稻纹枯病菌氨基酸合成和分泌的影响

【目的】为明确水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG 1-IA)黑色素形成前体物质酪氨酸等氨基酸成份在不同培养处理中的差异。【方法】利用氨基酸分析仪对水稻纹枯病菌在3种培养处理(PDB对照,添加了300μg/mL质量浓度莨菪碱的PDB和50μg/mL质量浓度儿茶酚的PDB)后菌丝体和发酵液的氨基酸成份进行了分析。【结果】水稻纹枯病菌菌丝体中谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸3种氨基酸含量相对比较丰富,而谷氨酸的含量最高,达到总氨基酸的15.49%;水稻纹枯病菌发酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量最为丰富,分别达到了总氨基酸的17.83%和58.21%;在3种处理中,不管是菌丝体还是发酵液中,都是谷氨酸和天冬氨酸最为丰富。影响水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成的前体物质酪氨酸的含量在3种处理的菌丝体中没有显著差异;但300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组中的苯丙氨酸含量都存在显著差异,而对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组的苯丙氨酸含量差异不显著。水稻纹枯病菌发酵液中对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组酪氨酸含量没有显著差异,但是300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组酪氨酸含量都存在显著差异,而苯丙氨酸在发酵液中差异不显著。【结论】影响水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液黑色素形成的氨基酸不同,苯丙氨酸对水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成更加重要,而酪氨酸对水稻纹枯病菌发酵液黑色素形成更加重要,以上结果为氨基酸对水稻纹枯病菌黑色素形成的影响提供了参考依据。     

化学物质对水稻纹枯病菌黑色素形成的影响

【目的】水稻纹枯病是由立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1 IA融合群引起的真菌病害,本研究旨在明确外界培养条件与水稻纹枯病菌黑色素形成的关系。【方法】采用菌丝生长速率法和紫外分光光度法,测定化学肥料[500μg/mL K_2SO_4、NaH_2PO_4、CO(NH_2)_2]、金属离子(5μg/mL CuSO_4、FeSO_4、ZnSO_4)、抗氧化剂(5μg/mL槲皮素、桑色素、抗坏血酸)和对照(300μg/mL莨菪碱、50μg/mL儿茶酚、水)对水稻纹枯病菌菌丝生长速率、菌核数量、菌核鲜质量和干质量以及黑色素含量的影响。【结果】500μg/mL K_2SO_4、NaH_2PO_4和CO(NH_2)_2,5μg/mL CuSO_4和ZnSO_4,5μg/mL槲皮素、桑色素和抗坏血酸以及50μg/mL儿茶酚溶液对水稻纹枯病菌黑色素的形成均有促进作用。其中,500μg/mL的CO(NH_2)_2处理下,水稻纹枯病菌产生黑色素最多,为113.2 mg;而300μg/mL的莨菪碱处理下,水稻纹枯病菌产生黑色素最少,为37.4 mg。【结论】水稻纹枯病菌黑色素的产生与菌丝生长速率和菌核发育没有必然的联系,即抑制菌丝生长和菌核发育的化学物质,不一定能够抑制黑色素的形成。本研究结果可为水稻纹枯病防控机理的研究提供依据。     

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

防治木薯细菌性枯萎病的生防菌株筛选和防效测定

从木薯8个不同生境分离到298株细菌,测定其产酶、次生代谢物和颉颃活性,结果表明,产蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶和生长素的菌株和比例分别为160(53.69%)、57(19.13%)、11(3.69%)和150(50.34%),产嗜铁素菌株最多203个,比例达68.12%;产几丁质酶的菌株最少7株,比例仅为2.35%;其中,9株菌株对木薯细菌性枯萎病菌具有颉颃活性,比例为3.02%。通过赋值选择88个得分较高的菌株,对其16S r RNA测序及ARDRA-PCR和BOX-PCR聚类分析,发现可分成21个簇,且每个簇的种群丰度较高。优选11个菌株进行日光温室大棚盆栽防效测定,其中,HWY-3-1防效为100%,防效在60%以上的菌株有DBS-5(85.96%)、HS-4-3(82.88%)、DHWP-1(79.37%)、HWYT-3-2(77.88%)、HWS-4-3(77.84%)、DHNS-3-5(65.34%)、DHWR-5-1(61.83%),和对照防效相比,差异显著;进一步选择5个防效较好的潜力菌株测定其田间防效,结果显示,HWY-3-1(Bacillus pumilus)平均防效为38.11%,与对照的防效存在显著差异。试验筛选策略可行,初步找到1株对CBB防效较稳定的生防菌株Bacillus pumilus。     

细胞自噬相关基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的定量分析

在前期研究中,采用RNA-seq技术获得了在水稻纹枯病菌菌核发育过程中差异表达的6个自噬相关基因,为阐明这些基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的表达模式,提取了菌核发育过程中3个阶段的RNA,根据特异基因的序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术分析这些基因的表达谱。结果表明,丝氨酸/苏氨酸激酶和ssp1、ATG13和Vam6基因的表达量在白色菌核形成阶段的表达量显著升高,而在菌核发育成熟阶段的表达量明显下降。而丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶基因和丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白基因的表达量在菌核发育阶段呈现出连续下降的趋势。研究发现这6个与细胞自噬有关的基因的表达谱与转录组测序的结果一致,表明转录组测序的结果可靠;同时也表明了这些基因高度响应了菌核的发育过程。     

产酸克雷伯氏菌游动性减弱突变体的筛选

以产酸克雷伯氏菌KO108为研究对象,通过构建转座子突变体文库,筛选获得2株游动性显著降低的突变菌株,并以转座子mTn5gusA-pgfp21构建突变体库,利用地高辛生物标记gfp基因序列作为探针,Southern杂交验证突变体库的质量,根据杂交条带判断mTn5gusA-pgfp21转座子插入染色体的拷贝数,以反向PCR获取未知序列,通过基因组学分析预测游动性相关基因。结果表明:产酸克雷伯氏菌KO108具Kan抗性标记、GUS活性、GFP遗传标记的突变体库可由两亲结合经转座子mTn5gusA-pgfp21转座突变获得;随机选择100株突变体进行游动性筛选,仅获得2株游动性显著降低的目标菌株MA和MD;MA、MD与KO108差异显著(P0.05),而MA和MD之间没有显著差异;Southern杂交结果显示MA和MD的转座子mTn5gusApgfp21为单插入,且插入位点所在的酶切片段大小不同;经反向PCR、测序、序列分析,发现MA突变基因为醌类氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase)(NQR)基因簇的NqrA,MD突变基因为LPS脂多糖生物合成基因簇基因;生长曲线检测显示KO108和MA、MD无显著差异;菌膜检测发现MD与KO108、MA有一定差异,但KO108与MA之间无显著性差异;以Biolog ECO检测KO108和MA、MD的碳源利用情况,结果表明MA和MD 72h后仍然不能利用羧酸类碳源D-半乳糖酸γ-内酯和2-羟基苯甲酸。