三角帆蚌kinase X基因的克隆及功能初探

三角帆蚌是我国特有的淡水育珠蚌,在养殖业中占有重要地位,在实际养殖过程中,雄性个体有着明显的产珠优势,因此对性别决定的相关研究至关重要。研究发现Sox9基因在许多物种中起到性别决定的作用,kinase X基因是蛋白激酶(PKA)合成中至关重要的基因,而Sox9基因很可能受到PKA激酶的调控。实验通过RACE法克隆kinase X基因的全长cDNA序列,使用荧光定量PCR的方法检测该基因在2龄雌雄三角帆蚌各组织中的相对表达量,利用RNA干扰技术研究干扰链对kinase X基因及下游基因Sox9基因表达的影响。结果显示,kinase X基因全长1 652 bp,编码430个氨基酸;荧光定量PCR结果显示,kinase X基因在雄性性腺中表达量最高,雌雄间差异极显著;RNA干扰结果显示,合成的干扰链均对kinase X基因有着一定的干扰效率,其中干扰链1的干扰率最高,在雌性中的干扰率为83.1%,雄性中为81.9%,同时干扰链1干扰后Sox9基因的表达量在雌性中下降了90.3%,雄性中下降了56.6%,推测这两个基因可能参与性别决定过程。本实验为三角帆蚌性别决定和雄性单性化育种研究提供理论基...     

插片后珍珠蚌生长性状及其无核珍珠成珠率和大小

为了筛选优质的珍珠蚌插片组合，探究不同种类珍珠蚌相互插片后生长性状间的差异和相关性，以及各组合无核珍珠成珠率和大小的差异，利用三角帆蚌(S)、池蝶蚌(C)和褶纹冠蚌(Z)分别作为供片蚌和育珠蚌，获得9个育珠蚌组合，测量各育珠组合的体质量、壳长、壳高和壳宽，比较9个育珠蚌组合及3个未插片的三角帆蚌、池蝶蚌和褶纹冠蚌对照组在1年后生长性状的差异，对各生长性状相关性进行分析。测量每个育珠蚌所产无核珍珠的数量和大小，计算成珠率和圆度，分析不同组合之间无核珍珠的差异。结果显示，无核育珠手术影响珍珠蚌的生长性能，以三角帆蚌和池蝶蚌为育珠蚌的组合生长性状均优于对照组，S-S育珠组合在以三角帆蚌为育珠蚌组合内生长最优，S-C和C-C育珠组合在以池蝶蚌为育珠蚌组合中生长最优，而以褶纹冠蚌为育珠蚌的组合插片后生长性状指标均小于对照组。其中除了池蝶蚌同种插片组合(C-C育珠组合)外，其余各育珠组合壳长与体质量间相关系数均高于其他生长性状间相关系数，C-C育珠组合壳宽与体质量相关系数最大；三角帆蚌和池蝶蚌之间的插片组合（S-S、C-S、S-C和C-C育珠组合）及褶纹冠蚌同种插片组合（Z-Z育珠组合）成珠率较高(91.67%~100%)。S-S、S-C和C-C育珠组合所育珍珠较圆但珍珠大小在各育珠组合内处于中等。研究表明，无核育珠手术改变珍珠蚌的生长性能，不同育珠组合生长性能存在差异，S-S、S-C和C-C育珠组合插片后生长性能较好，成珠率高，珍珠较圆但珍珠大小在各育珠组合中处于中等，该结果为探索不同珍珠蚌生长性状差异和相关性及其所产无核珍珠成珠率、大小的比较提供重要依据。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用，通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA，共1560 bp，其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp，开放阅读框（ORF）为1140 bp，可以编码379个氨基酸，且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后，发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达，表明其参与了多样的生物学过程，在腮、斧足、肝中表达量较高，在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异，且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示，WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号，推测WNT4基因与性别决定相关。     

淇河鲫R-spondin1基因cDNA克隆和表达

为探索R-spondin1(Rspo1)基因在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,本研究利用RACE技术克隆Rspo1基因cDNA序列,同时分析它的时空表达模式,并检测芳香化酶抑制剂Letrozole及高温养殖诱导性逆转下它在性腺中的表达情况。将扩增的PCR产物经亚克隆测序、拼接后获得淇河鲫Rspo1 cDNA序列,长1 243 bp(MH243761),包含5′非编码区318 bp,3′非编码区127 bp和开放读码框798 bp,共编码265个氨基酸残基。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Rspo1与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性相对较低;组织分布检测结果显示,Rspo1基因在淇河鲫各个组织中均有表达,其中肌肉组织表达量最高,卵巢次之,而在脾脏、肾脏、心脏组织中表达量较低;在胚胎发育过程中Rspo1的表达量在未受精卵与受精卵中无差异,随着胚胎发育而降低,神经胚期最低,从尾芽期至出膜期又逐步升高。胚后阶段,Rspo1在性腺中的表达量从淇河鲫性别决定与分化关键时期(孵化后20 d)开始上调。Letrozole处理或高温养殖引起的性逆转中,Rspo1在性腺中表达量升高。研究表明,淇河鲫Rspo1作为一个母源性因子可能在卵巢分化与维持中起到一定作用,同时它可能也参与精子发生过程。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。