沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。     

不同氮肥处理对西北区春玉米产量的影响

为确定不同生产条件下的玉米适宜施氮量,以及控释肥的应用前景,本试验设置5个施氮水平(0、120、180、240、300 kg·hm~(-2))、2种氮肥种类(速效氮肥和控释氮肥),研究了不同氮肥处理对西北春玉米农艺性状、产量及产量构成因素的影响。结果表明,增施氮肥能改善西北区春玉米的农艺性状,随着施氮量的增加,玉米株高、穗位高显著增加,增长范围分别为3.1%～32.8%和3.3%～10.8%,但速效氮肥和控释氮肥处理间无明显差异;不同施氮量较不施氮处理能显著提高穗长、穗粗,降低秃尖长度,行粒数、千粒重和产量呈现先增加后降低的趋势,当施氮量为180 kg·hm~(-2)时,产量均达到最大值,可增产8.8%～15.8%,不同氮肥种类间差异不显著。通过产量与施氮量的回归方程分析,发现施氮量为167.7～205.4 kg·hm~(-2)时,产量较高。     

草莓白化相关病毒中国分离物全基因组分析

草莓白化相关病毒(strawberrypallidosis-associatedvirus,SPa V)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus),可引起草莓病害,2017年在中国首次报道。采用高通量测序、RACE和RT-PCR技术获得了SPa V中国分离物(FJ)的基因组全长。该病毒含有两条正单链基因组RNA1和RNA2。RNA1全长8 048 nt,5′和3′非编码区序列分别为264和197 nt,含有3个开放阅读框(ORF),分别编码ORF 1a/1b融合蛋白和p9蛋白。RNA2全长7 977 nt,5′和3′非编码区序列分别为248和186 nt,含有8个开放阅读框(ORF),分别编码HSP70h、CPh、CP、CPm、p7、p6、p9和p28等8个蛋白。RNA1和RNA2与美国M1分离物分别具有98.5%和99.0%的核苷酸一致性;系统发育分析结果表明,SPa V中国分离物(FJ)单独处在一个分支。对SPa V来源的小RNA的分析表明,来源于SPa V的小RAN长度以21和22 nt为主。     

木尔坦棉花曲叶病毒编码蛋白的亚细胞定位分析

 木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)是典型的单组分双生病毒,并伴随β卫星分子,是棉花曲叶病的主要病原之一。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达系统,将CLCuMV及其卫星分子编码的7个病毒蛋白在本氏烟表皮细胞中表达。通过激光共聚焦显微镜观察发现:V1、C2和C3定位于细胞核;C1和βC1定位在细胞核以及细胞质或细胞膜上,并且在细胞质中形成丝状结构;V2和C4主要定位在细胞质或细胞膜上,细胞核也有微量表达,V2可形成大小不一的颗粒状聚集体结构,C4在细胞膜上可见点状聚集体结构。同时,利用RT-PCR和Western blot对病毒各基因的转录和表达水平进行了分析。CLCuMV编码蛋白的亚细胞定位为蛋白功能的进一步研究提供重要理论依据。     

粉红螺旋聚孢霉NF-06固体发酵条件优化及对南方根结线虫的防治效果

南方根结线虫是一种严重危害我国蔬菜安全生产的土传病害，生产上亟需一种有效的防控方法。本研究从根结线虫卵囊中分离到一株生防真菌NF-06，通过形态学和分子生物学方法将其鉴定为粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea。通过离体活性测定的方法测定NF-06发酵滤液对根结线虫2龄幼虫的致死作用，发现24、48和72 h后2龄幼虫的相对死亡率分别达63.6%，75.5%和87.0%。以产孢量为指标，优化菌株NF-06固体发酵条件，确定最佳基础培养基为麦麸和麦秸秆混合物，其比例为4：1（wt/wt），在基础培养基中添加10%玉米粉、2%蚕豆粉和0.05% KH₂PO₄可获得最大产孢量；最优培养条件为初始pH值7.0，初始含水量40%，接种量5%，产孢量达8.9×10¹⁰ CFU/g。室内盆栽防治效果测定显示，菌株NF-06固体发酵物能够有效降低土壤中的线虫数量和番茄根结指数，其中5 g/株穴施处理的线虫减退率和防治效果分别达67.9%和69.6%。本研究为生物杀线虫剂的开发和利用提供理论依据。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

茶毫氨基酸组成及矿质元素分析

成茶白毫的多少及隐显是评定茶叶品质优劣的重要标志之一。为了明确茶毫中的化学组成,以富含茶毫的碧螺春、滇红、白毫银针及白牡丹4个茶样为研究对象,将茶毫与茶身进行分离,利用碳氮元素分析仪对其总碳、总氮及碳氮比进行分析,氨基酸自动分析仪分析其氨基酸组分,电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)用来测定其主要矿质元素含量。茶毫中的C、N含量分别为2.96%~4.74%和42.87%~45.58%,其中N含量显著低于茶身(P0.01),C含量差异不显著,C/N茶毫显著高于茶身;茶毫中水解氨基酸、游离氨基酸含量分别为10.78%~12.46%和20.78~34.65 mg·g~(-1),其中水解氨基酸主要组分及总量均显著低于茶身(P0.01),游离氨基酸总量低于茶身(P0.05),而茶氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、γ-氨基丁酸等游离氨基酸组分差异不显著,茶毫中茶氨酸所占游离氨基酸的比例显著高于茶身(P0.05);茶毫中的矿质元素普遍低于茶身,其中P、S含量极显著低于茶身(P0.01),其他元素差异不显著。由此可见,茶毫中的氨基酸和矿质元素含量并不比茶身高,但品质成分组成比例的差异赋予了富含茶毫茶叶特有的品质特征。     

7株根瘤菌菌株与热研2号柱花草共生最适磷浓度研究

采用水培的方法,设3个磷水平,7个菌株,通过对株高、茎叶鲜重、茎叶干重、固氮酶活性、茎叶氮含量、茎叶磷含量的测定及综合分析,确定使热研2号柱花草接种不同根瘤菌菌株达到最佳促生性能的磷浓度。结果表明:7个菌株在中磷时鲜重和含氮量最大,低磷不利于鲜重和含氮量的增加;经主因子综合分析,菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在高磷时对热研2号柱花草有最好的固氮促生效果,菌株LZ3-2、BS1-1、PN13-3在中等磷条件下有最好的固氮促生效果,菌株FS3-1-1在高磷和中磷都有最好的固氮促生效果。