利用 CRISPR/Cas9 系统编辑拟南芥 2 个双链结合蛋白

CRSPR/Cas9 系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑，为获得基因缺失突变体提供了新的方向。本研究在双链结合蛋白（dsRNA-binding protein，DRB）DRB3 和 DRB5 两个基因外显子的保守序列设计 2 个靶点，并构建与 tRNA 串联的双靶点 CRISPR/Cas9 表达载体。通过一次转化，获得了 DRB3 或 DRB5 单独被编辑或同时被编辑的拟南芥突变体 dcl2drb4 转基因 T1 代植株，为研究 DRB3、DRB5 是否参与 DCL4 介导的抗病毒 RNA 沉默通路奠定基础。     

热带牧草种子抗真菌蛋白筛选初报

利用琼脂纸片扩散法对262种热带牧草种子水提取物进行抑立枯丝核菌活性试验,结果表明:其中有24种热带牧草种子的水提取物对立枯丝核菌菌丝生长具有显著的抑制作用,它们分属金合欢属、朱缨花属、蝶豆属、银合欢属、决明属和灰毛豆属;水提取物进一步用链霉蛋白酶E消化处理,发现只有蝶豆种子提取物中存在抗真菌蛋白.     

橡胶延长因子基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

[目的]制备橡胶延长因子重组蛋白及其多克隆抗体。[方法]用RT-PCR法扩增橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)编码区基因,将其克隆到原核表达载体pDEST17中,转化大肠杆菌BL21-AI,用L-阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达,并采用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA和W estern blot对抗体效价和特异性进行鉴定。[结果]高效表达和纯化了橡胶延长因子重组蛋白,用其免疫家小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗体,W estern blot检测显示该抗体可识别胶乳中的天然橡胶延长因子。[结论]成功获得橡胶延长因子重组蛋白,制备了效价高、特异性好的鼠抗橡胶延长因子抗体,为进一步橡胶延长因子及其他橡胶粒子膜蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

双T-DNA表达载体转化大豆的研究

利用含有筛选标记基因和目的基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%.PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上.RT-PCR检测结果显示,玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达.     

橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

为探索适合橡胶草基因组DNA的提取方法和RAPD反应体系。采用改良CTAB法提取橡胶草叶片总DNA，得到的DNA能满足RAPD分析需要。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD扩增结果的影响，建立了适合于橡胶草RAPD分子标记的最佳反应体系，即20 μL体系中包括：模板DNA30 ng、Taq DNA聚合酶1.75 U、dNTPs浓度0.25 mmol/L、Mg2+浓度2.0 mmol/L、引物浓度0.5 μmol/L、10×PCR Buffer 2.0 μL。RAPD扩增反应程序为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，37℃ 30 s，72℃ 70 s，45个循环，最后72℃延伸10 min。该反应体系具有较好的稳定性及可重复性。     

影响木薯再生系统的几个因素的研究

以木薯7个优良品种SC6,SC7,SC8,SC124,NZ188,C3以及C4为实验材料,对木薯再生体系中的几个重要影响因素进行了研究.结果表明:6 - BA对抑制木薯的顶端优势有明显的效果,浓度越高抑制作用越强；2,4-D和picloram能促进木薯初级体胚的形成,两者效果相当,在初级体胚诱导过程中,所有品种的产胚率...     

拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT10上游非编码区,并与pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体pNUDT10P-GUS,采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3.5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT10启动子,该启动子为组成型表达的启动子,并且病原菌Pst.DC3000及Pst.DC3000AvrB对该启动子没有诱导作用。     

木薯叶片染色体制片技术研究

以木薯嫩叶为材料，对其染色体制片技术的取样时间、预处理药剂、固定液、解离方法以及染色剂等方面进行了试验研究。结果表明：取材时间为上午8：30~10：00，用0.1％秋水仙素与0.002 mol/L 8-羟基喹啉混合液室温预处理 3 h，经固定液（无水酒精 ∶ 氯仿 ∶ 冰醋酸=6 ∶ 3 ∶ 1）固定，用1 mol/L盐酸60 ℃下解离8 min，再用改良苯酚品红染色压片镜检，能取得良好的分裂相效果。     

拟南芥AtNUDT8启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物，以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT8上游非编码区，并与pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体pNUDT8P-GUS，采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥，通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株，再对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析，并对3.5~4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明：已获得AtNUDT8启动子，该启动子为组成型表达启动子，并且病原菌Pst.DC3000对该启动子无诱导作用。     

利用mRNA差别显示技术分离橡胶树死皮病相关cDNA

从中国热带农业科学院橡胶树早期预测试验地采集不同品系的橡胶树胶乳和树皮组织，分别提取纯化mRNA 合成cDNA第一链。通过4个简并锚定引物和10个随机引物进行PCR扩增，经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了至少4个差异DNA片段只在健康树中表达而在死皮树中没有出现，这4个差异DNA片段分别命名为Hb1(725bp),Hb2,Hb3,Hb4。对Hb1进行了分离，纯化，经Northern杂交证实，Hb1在健康树胶乳中表达活跃，而在死皮树胶乳中表达受到强烈抑制，表明Hb1是与死皮病相关的cDNA片段，进一步将Hb1片段进行回收和克隆，并进行DNA序列分析，序列在GenBank中进行BLAST分析未发现相关同源片段，死皮病相关cDNA片段的获得，将分离全长死皮病相关基因，搞清该基因表达调控的机理提供条件，进而为从分子水平上阐明死皮病的致病机理打下了基础。