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旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因片段克隆至原核表达载体pET30a-(+)中进行表达,并纯化。利用Western blot方法检测纯化蛋白质与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清的反应性,并检测其对小鼠的毒力。随后,以纯化的重组蛋白质免疫兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,ε毒素的重组突变体为可溶性表达,通过灰度扫描,其表达量比例可达40%;该蛋白质能与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清反应,小鼠安全试验显示,6.25×106 ng·kg-1的蛋白质仍无毒力;免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌ε毒素的中和效价在一免后可达50~60最小致死量(MLD),二免后可达400~450 MLD;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到保护。由此表明,产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性,为D型产气荚膜梭菌病新型疫苗的研制提供了重要的实验数据。 相似文献
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本研究旨在获得腐败梭菌无毒重组α毒素,并评价其免疫保护性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计和人工合成,获得了缺少第212-222位共11个氨基酸编码序列的基因片段(GCSAΔ11)。将该基因克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化。利用Western blot方法检测获得的重组α毒素(rCSAΔ11)与腐败梭菌天然毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测其毒力。随后,以rCSAΔ11制备疫苗免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSAΔ11可溶表达比例可达46%,且能与腐败梭菌天然毒素抗血清反应。进一步的试验结果显示,rCSAΔ11丧失了对小鼠的毒力,0.1 mL的一免兔血清可中和8~12个小鼠最小致死量(MLD)的腐败梭菌天然毒素;二免兔血清可中和32~45个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素。1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。综上表明,无毒性的rCSAΔ11保留了良好的免疫保护性,从而为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。 相似文献
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本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白(MBP)和C型肉毒梭菌毒素重链C末端(CHC)的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCHC。将GMBPCHC克隆至pET28a-(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,分别在15和37℃两种温度条件下诱导表达。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rMBPCHC。将rMBPCHC与Montanide ISA 201佐剂混合制备成疫苗,免疫4只家兔,剂量为100 μg/只。根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免后21 d及二免后14 d家兔血清的中和抗体效价。同时,在二免后14 d对家兔进行攻毒。结果表明,rMBPCHC在37℃的诱导温度下,主要以包涵体的形式表达;在15℃的诱导温度下,可溶性表达的比例可达50%。一次免疫后,免疫组4只家兔血清对C型肉毒梭菌天然毒素(简称天然毒素)的中和效价均可达到1(0.1 mL血清中和1个小鼠最小致死量(MLD)的天然毒素)。二免后,家兔血清的中和抗体效价可达到4~8。用10个家兔MLD的天然毒素攻毒后,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护,而用1个家兔MLD的天然毒素攻毒后,对照组家兔100%(2/2)死亡。以上结果说明,rMBPCHC具有良好的免疫原性,从而为C型肉毒梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。 相似文献
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采用小鼠脑内接种法对保存不同年代的5批狂犬病病毒(Flury株)鸡胚低代毒(LEP)毒种进行病毒含量测定,并将每批毒种分别肌肉注射3月龄健康易感犬,21 d后采用小鼠脑内中和试验和荧光抑制试验分别测定犬血清抗体效价,评价毒种的免疫原性。结果显示,5批毒种每0.03 mL的病毒含量分别为104.67LD50、104.67LD50、103.5LD50、103.5LD50、104.17LD50;5批毒种免疫的10只犬血清抗体效价采用两种方法测定均达到1∶32以上,结果表明狂犬病病毒(Flury株)毒种在-70℃保存12年病毒含量仍符合标准规定,并保持有良好的免疫原性。 相似文献
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旨在获得产气荚膜梭菌β毒素(CPB)的重组突变体,并评价其毒力及免疫保护性。对已知的产气荚膜梭菌CPB编码基因进行优化设计,同时引入4个氨基酸突变位点,分别是第212位的精氨酸突变为谷氨酸,第268位的亮氨酸突变为甘氨酸,266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸。此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端的编码序列,经人工合成获得重组基因片段(GTFNCPBm4)。将GTFNCPBm4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTFNCPBm4。利用Western blot方法检测rTFNCPBm4与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性,并检测rTFNCPBm4对小鼠的毒力。随后,以rTFNCPBm4免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。结果表明,rTFNCPBm4主要以包涵体的形式表达且能与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。小鼠安全性试验显示,50 μg的rTFNCPBm4对小鼠仍无致死性;免疫rTFNCPBm4后,每毫升家兔二免抗血清可中和10~20个小鼠最小致死量(MLD)的C型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rTFNCPBm4在丧失毒力的同时保留了良好的免疫原性,从而为C型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的数据。 相似文献
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本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。 相似文献
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为研制犬腺病毒相关制品的检验用阳性血清,以健康易感山羊为免疫靶动物,深入优化免疫原和免疫程序,无菌采血后分离血清,并分装冻干。通过常规检验方法进行纯净性检测、特异性检测、抗体效价测定和中和指数测定,并将其应用于代表性的含犬腺病毒组分的活疫苗制品的外源病毒检验和鉴别检验等。结果显示,该批血清的纯净性检验和特异性满足要求,中和抗体效价为1∶9364,中和指数10~(6.0)。结果表明,该血清对犬腺病毒具有良好的中和作用,能够应用于犬腺病毒相关制品的外源病毒检验和特异性检验等,是兽用生物制品国家标准物质的重要候选标准品。 相似文献
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为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白r ETXH106P。利用Western blot方法检测r ETXH106P与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将r ETXH106P与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,r ETXH106P为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100μg/m L的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×106ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌r ETXH106P重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。 相似文献
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本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA) C末端(第247-370位氨基酸,CPAC)三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC编码基因(GenBank登录号:AY823400.1)进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因(GCPAC3),片段之间用柔性氨基酸linker (GGGS)连接,经人工合成后克隆至原核表达载体pET-30a (+)中进行表达与纯化,获得CPAC的三拷贝重组蛋白(rCPAC3)。利用Western blotting方法检测rCPAC3与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。将rCPAC3与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔最低致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPAC3对家兔的免疫保护效果。结果显示,rCPAC3主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;每毫升的一免抗血清可中和30~50个、二免抗血清可中和70~100个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。采用1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%(4/4)死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPAC3具有良好的免疫原性,为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。 相似文献