莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中有重要作用,高等植物中PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量,但是对绿藻PEPC的研究还较少.莱茵衣藻是绿藻中的模式生物,其基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高,为了提高外源蛋白表达和获得高产油莱茵衣藻,利用叶绿体转化法能进一步提高表达效率.因此,本研究首先克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPCCS Ⅰ (conserved sequence Ⅰ)的639 bp,构建了pASapI-reve-Crpepc2和pASapI-forw-Crpepc2正反向叶绿体表达载体,并用基因枪法转化莱茵衣藻cc-400获得了空质粒型,正向型和反向型转基因藻株.其次,应用RT-qPCR方法检测Crpepc2的相对表达量,结果表明反向型Crpepc2的表达量减少了89.97％,而正向型增加了201.16％.最后,检测了总蛋白和脂质含量的变化,正向型突变株的总蛋白增加了37.03％;而反向型突变株的脂质含量增加了70.32％,且不饱和脂肪酸含量明显增加.以上结果证明莱茵衣藻“细菌型”PEPC的叶绿体表达不仅可以进一步提高蛋白质与脂肪酸含量,也可为今后外源蛋白的表达和高产油工程藻的应用做贡献.     

转基因及相关亚品系鱼腥藻的纯化

转基因蓝藻纯化是研究其生理、生化、分子生物学、营养学、药理学、毒理学等必不可少的环节,更是其作为生产原料的基础。传统纯化方法仅对不同物种间的分离进行了讨论,尚未涉及野生藻种和转基因突变株在实验和生产中相互污染情况下的鉴别和分离。本文的转基因藻纯化方法先后从种群、细胞、分子3个层面纯化分离了藻种。该方法使用平板划线的方法将杂藻杂菌与鱼腥藻分离,再使用核酸电泳、RT-qPCR、Western Blot将鱼腥藻野生种、转空载体突变株以及转目的基因突变株3个亚品系逐步分离。纯化分离后的藻株生长速率得到了提高,目的基因的表达效率增长,生产目的蛋白的产率自然增长。本研究对转基因藻在实验和生产中出现的一些问题提出了相应的解决方案,对转基因微藻的应用具有积极的作用。     

莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31）在植物碳代谢中有重要作用，高等植物中PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量，但是对绿藻PEPC的研究还较少。莱茵衣藻是绿藻中的模式生物，其基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高，为了提高外源蛋白表达和获得高产油莱茵衣藻，利用叶绿体转化法能进一步提高表达效率。因此，本研究首先克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPCCSⅠ（conserved sequenceⅠ）的639 bp，构建了pASapI-reve-Crpepc2和pASapI-forw-Crpepc2正反向叶绿体表达载体，并用基因枪法转化莱茵衣藻cc-400获得了空质粒型，正向型和反向型转基因藻株。其次，应用RT-qPCR方法检测Crpepc2的相对表达量，结果表明反向型Crpepc2的表达量减少了89.97%，而正向型增加了201.16%。最后，检测了总蛋白和脂质含量的变化，正向型突变株的总蛋白增加了37.03%；而反向型突变株的脂质含量增加了70.32%，且不饱和脂肪酸含量明显增加。以上结果证明莱茵衣藻“细菌型”PEPC的叶绿体表达不仅可以进一步提高蛋白质与脂肪酸含量，也可为今后外源蛋白的表达和高产油工程藻的应用做贡献。