中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因 及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2. 0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为：GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。     

中蜂来源的微孢子虫对意蜂工蜂的侵染性研究

为探讨中蜂来源的微孢子虫对意蜂的侵染性,本试验将纯化自中蜂的微孢子虫,以每只蜂1×105个和5×105个孢子的接种量,分别给2日、5日、8日、11日龄无微孢子虫感染的意蜂成年工蜂接种,在30℃±0.5℃,65%～80%RH,黑暗中隔离饲养10日后,各日龄工蜂的平均感染率达86.3%～100%,每只蜂中肠的平均产孢量为5.60×105～3.39×106个。在两接种量下,2日、5日龄意蜂工蜂的产孢量均显著(P<0.05)高于8日、11日龄的产孢量。试验首次证实了中蜂来源的微孢子虫对意蜂成年工蜂具较强的侵染性。     

响应面法优化蜂蜜酸奶的发酵工艺

 在单因素实验的基础上,采用响应面分析实验方法,优化蜂蜜与鲜奶比例、发酵温度、接菌量等影响蜂蜜酸奶发酵效果的工艺参数。经Design ExpertV8.0.6软件对试验结果进行分析,确定蜂蜜酸奶生产的最优工艺参数为：m（蜂蜜/g）∶V（鲜奶/mL）=8.13∶71.87,接种量2.30%,发酵温度42.30℃。在此条件下,还原糖转化率为9.47%,与理论值9.58%的相对误差约为1.15%。该蜂蜜酸奶发酵的最佳工艺参数在生产上具有一定的指导意义。     

我国蜂业机械设备现状与发展

目前,蜂业机械设备可以分为两大类,一类是蜜蜂机具类,一类是蜜蜂产品机具类。蜜蜂机具类主要是用于蜂群饲养管理及蜜蜂产品生产相关的器具设备。蜜蜂产品机具类主要是用于蜂产品的检测及加工相关的器具设备。蜜蜂机具蜜蜂机具是用于蜜蜂饲养管理及蜜蜂产品生产相关的设备或是器具,种类比较多,大致可分为蜜蜂基础管理类及蜜蜂产品生产类。蜜蜂基础管理类包括:供蜜蜂生长繁殖的蜂箱、巢脾、隔板等;人工管理蜂群所需的蜂帽、蜂     

响应面法优化王浆蛋白酶解工艺研究

采用响应面分析法,优化胃蛋白酶酶解王浆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件,以1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)清除率为响应值,研究了酶与底物的比值([E]/[S])、底物浓度以及酶解时间对蜂王浆酶解物抗氧化的影响.结果表明,最终确定出制备抗氧化肽的最优酶解条件为,[E]/[S]2.24％、底物浓度1.61％、酶解时间3.7h,在该条件下制备的王浆蛋白酶解物的DPPH自由基清除率为47.84％.     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中长链非编码RNA的竞争性内源RNA调控网络及潜在功能

【背景】 长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度>200 nt且不具有编码能力的转录本,能够在真核生物的转录水平和转录后水平通过顺式（cis）、反式（trans）或竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制调控基因的表达,已被证明在生物体的生长和发育等生物学过程中发挥重要的调控作用。【目的】 结合测序得到的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子的small RNA（sRNA）组学数据和前期获得的lncRNA组学数据对lncRNA的调控方式进行深入细致的分析和探讨,揭示lncRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的潜在功能。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子进行测序,通过相关的生物信息学软件对测序数据进行质控。根据lncRNA与mRNA的位置关系预测lncRNA的上下游基因;使用Blast软件比对GO和KEGG数据库,对上下游基因进行功能和代谢通路注释;利用Target Finder软件预测lncRNA-miRNA及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.2软件对调控网络进行可视化;利用RT-PCR对调控网络中的部分lncRNA、miRNA和mRNA的表达进行验证。【结果】 东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子样品的sRNA-seq分别得到16 597 883、15 451 791和12 248 316条raw reads,经质控分别得到15 608 370、14 249 255和11 440 684条clean reads,各样品的Q30≥98.58%。共预测出lncRNA的上下游基因310个,它们可注释到代谢进程、细胞进程、催化活性、结合和细胞等相关的35个功能条目;此外还可注释到56条代谢通路,涉及嘌呤代谢、碳代谢和丙酮酸代谢等物质代谢通路,以及甲烷代谢、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路。上述结果表明相应的lncRNA可能通过cis作用调节上下游基因的表达,从而参与调控东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢以及细胞生命活动。进一步构建lncRNA-miRNA调控网络,分析结果显示MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1可靶向结合4个miRNA（nce-miR-7729、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-8565）,说明此3个lncRNA可作为ceRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中发挥潜在作用。LncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析结果显示,三者之间形成较为复杂的调控网络关系,miRNA处于调控网络的中心并联系lncRNA和mRNA,nce-miR-7502和nce-miR-8639结合的mRNA最多,达到28个;与MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1存在靶向关系的miRNA结合多个mRNA,表明上述3个lncRNA可能通过ceRNA机制发挥作用,从而影响东方蜜蜂微孢子虫孢子中的新陈代谢和生命活动。【结论】 lncRNA可能通过cis作用调控上下游基因的表达,以及作为ceRNA通过吸附miRNA间接影响靶基因的表达,从而参与调节东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢等基本生命活动。     

蜜蜂球囊菌中长链非编码RNA的调控作用

【目的】长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类二、三级结构高度保守,长度>200 nt且不具蛋白编码能力的RNA,在转录和转录后水平广泛参与调控剂量补偿、细胞分化和生长发育等生命活动。本研究基于前期获得的蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）菌丝和孢子混合样品的高质量lncRNA组学数据进行球囊菌lncRNA的顺式（cis）作用、反义lncRNA（antisense lncRNA）作用和竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）作用的分析和探讨,以期揭示lncRNA在球囊菌中的潜在功能。【方法】基于lncRNA基因在染色体上的位置,预测lncRNA上下游100 kb以内的蛋白编码基因;使用Blast软件将上下游基因比对到GO和KEGG数据库,以获得功能和通路注释。利用LncTar软件对反义lncRNA的靶mRNA进行预测,并使用Blast软件将上述靶mRNA比对到KEGG和eggNOG数据库。利用TargetFinder软件预测lncRNA靶向结合的miRNA及miRNA靶向结合的mRNA,根据靶向结合关系建立lncRNA-miRNA和lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.1软件进行调控网络的可视化。利用RT-PCR对调控网络中的lncRNA、靶miRNA和靶mRNA进行表达验证。【结果】共预测出371个lncRNA的5 852个上下游基因,可注释到细胞进程、代谢进程和应激反应等48个功能条目,以及新陈代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等121条通路,表明部分lncRNA可通过顺式作用调节上下游基因的表达,从而参与调控球囊菌的生长发育及物质能量代谢等基础生命活动。球囊菌的7个lncRNA与7个靶mRNA存在序列互补关系,其中5个mRNA在eggNOG数据库中仅注释为假定蛋白,仅gene3444在KEGG数据库注释为核孔复合体蛋白An-Nup120和假定蛋白,表明上述1个反义lncRNA可能参与调控核孔复合体蛋白的生物合成等生物学过程。此外,共预测出227个lncRNA与73个miRNA之间存在靶向结合关系,其中多数lncRNA(79.02%)仅能结合1—2个miRNA,部分miRNA可被多个lncRNA靶向结合;进一步构建氧化磷酸化通路和MAPK信号通路相关的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,分析结果显示氧化磷酸化通路相关的222个lncRNA靶向78个miRNA及50个mRNA,MAPK信号通路相关的222个lncRNA靶向76个miRNA及46个mRNA,表明部分lncRNA通过ceRNA作用调控此两条通路,从而影响球囊菌的能量合成、环境适应以及生长发育等过程。【结论】部分lncRNA可能通过顺式作用和ceRNA作用调节球囊菌的生长发育、物质能量代谢以及环境适应等生物学过程;MSTRG.5393.1可能作为反义lncRNA调控球囊菌的核孔复合体的蛋白合成。     

利用第三代纳米孔长读段测序技术构建和注释蜜蜂球囊菌的全长转录组

【目的】利用第三代纳米孔（nanopore）长读段测序技术对蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）的纯化菌丝（Aam）和孢子（Aas）进行测序,构建和注释球囊菌的高质量全长转录组。【方法】通过Oxford Nanopore PromethION平台对Aam和Aas进行测序。利用Guppy软件对原始读段（raw reads）进行碱基识别（base calling）,通过过滤短片段和低质量原始读段得到有效读段（clean reads）。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。通过比对Nr、Swissprot、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库获得全长转录本的注释信息。分别利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam 4种方法对长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）进行预测,取四者的交集作为高可信度的lncRNA。【结果】Aam和Aas的纳米孔测序分别测得6 321 704和6 259 727条原始读段,经质控得到5 669 436和6 233 159条有效读段,其中包含的全长有效读段分别为4 497 102（79.32%）和4 963 101（79.62%）条。共鉴定到9 859和16 795条非冗余全长转录本,N50分别为1 482和1 658 bp,平均长度分别为1 187和1 303 bp,最大长度分别为6 472和6 815 bp。Venn分析结果显示有6 512条非冗余全长转录本为菌丝和孢子所共有,分别有3 347和10 283个非冗余全长转录本为二者特有。此外,在球囊菌菌丝和孢子中共鉴定到20 142条全长转录本,其中分别有20 809、11 151、17 723、12 164、11 340和9 833条全长转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库。注释全长转录本数量最多的物种是球囊菌、Polytolypa hystricis和荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）。GO数据库注释结果显示,上述全长转录本可注释到45个功能条目,涉及细胞组件、细胞和细胞器等细胞组分相关条目;催化活性、结合和转运器活性等分子功能相关条目;以及细胞进程、代谢进程和单一组织进程等生物学进程相关条目。KEGG数据库注释结果显示,上述全长转录本还可注释到抗生素的生物合成、核糖体、氨基酸的生物合成、碳代谢和剪接体等49条通路。此外,鉴定到648条高可信度的lncRNA,包含480条基因间区lncRNA、119条反义链lncRNA和49条正义链lncRNA。【结论】构建和注释了球囊菌的首个高质量全长转录组,为探究球囊菌转录组的复杂性,完善参考基因组的序列和功能注释信息以及深入开展球囊菌可变剪接体的功能研究提供了关键依据。     

意大利蜜蜂4、5和6日龄幼虫肠道发育过程中差异表达基因的趋势分析

为探讨意大利蜜蜂(简称意蜂)幼虫肠道发育过程中的基因表达谱和基因差异表达信息,研究基于前期已获得的高质量的意蜂幼虫肠道转录组数据,利用STEM软件对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道的差异表达基因(DEGs)进行趋势分析,进一步通过相关生物学软件对显著上调趋势包含的DEGs进行GO与KEGG代谢通路富集分析及表达量聚类分析。趋势分析结果显示,5 920个DEGs共聚类在8个基因表达模式,其中935个DEGs聚类在1个显著上调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于39个GO条目,富集基因数最多的为结合,其次是细胞进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于94个代谢通路,富集基因数最多的是嘌呤代谢、内质网蛋白质加工和内吞作用。表达量聚类分析结果显示,随着意蜂幼虫肠道发育时间的延长,代谢和免疫相关通路富集基因的表达水平逐渐增强。研究提供了意蜂幼虫肠道发育过程的基因表达谱和基因差异表达信息,揭示了基因表达规律,为深入研究意蜂幼虫肠道发育的分子机制打下了一定基础。