以重组PvpA蛋白作为抗原的鸡毒支原体抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鸡毒支原体(MG)种特异性检测的间接ELISA检测方法,本研究以原核表达的PvpA蛋白作为包被抗原,初步建立了检测MG抗体的间接ELISA检测方法.特异性试验结果表明,重组PvpA蛋白与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、滑液支原体、大肠杆菌“O”抗原、禽沙门氏茵“O”抗原阳性血清均不发生交叉反应.该方法的批内变异系数小于8％,批间变异系数小于11％,表明具有较好的重复性.采用该检测方法与进口试剂盒对不同省份送检的鸡血清进行检测比较,两者阳性和阴性符合率均达到90％以上.本研究建立的间接ELISA检测方法为MG抗体检测试剂盒的研制奠定了基础.     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列，在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因，将其连接到PMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中，经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线，并进行特异性，灵敏性，重复性及临床样本检测试验，评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍；无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增，该方法都呈现很好的特异性；重复性试验中，批内和批间变异系数均小于2%，表明该方法重现性好；临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法，为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

耐氟喹诺酮类药物鸡毒支原体DNA回旋酶及拓扑异构酶Ⅳ的突变特征

采用二倍稀释法测定临床分离的4株鸡毒支原体对常用抗菌药物的敏感性,PCR方法和基因测序法对鸡毒支原体DNA回旋酶编码基因gyrA、gyrB及拓扑异构酶Ⅳ编码基因parC和parE耐药决定区进行分析。敏感性测定结果表明,4株分离鸡毒支原体对泰乐菌素、泰妙林、沃尼妙林和替米考星有很高的敏感性,对四环素和红霉素中度敏感,对林可霉素、氟苯尼考和氟喹诺酮类药物呈现不同程度的耐药性。4株耐氟喹诺酮类药物鸡毒支原体均在GyrA和ParC的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)发生氨基酸的改变,GyrA的氨基酸取代模式有两种,分别为Ser81→Gly和Ser83→Ile,ParC仅在80位发生氨基酸取代(Ser80→Leu),GyrB和ParE均未发生氨基酸改变。     

食品动物源沙门菌oqxAB基因的检测及水平传播机制研究

为了调查食品动物源沙门菌Salmonella oqxAB耐药基因的流行情况和水平传播机制,采用二倍琼脂稀释法测定临床分离的31株沙门菌对常用抗菌药物的敏感性,PCR方法特异扩增耐药基因oqxAB,并对扩增产物克隆测序.通过接合转移试验验证oqxAB基因的水平传播.试验结果表明,31株沙门菌对氨苄霉素的耐药率最高,达64...