CircCEP85L对牛肌肉干细胞增殖、成肌分化的调控

【目的】目前，越来越多的研究证明环状RNA(circRNA)在牛肌肉发育过程中扮演着重要的角色，但其分子调控机理尚未完善。通过挖掘与牛肌肉发育相关的circRNA的作用机制，为进一步阐明其调控牛肌肉发育的分子机制奠定基础。【方法】以前期分析的增殖期(GM)与成肌分化期（DM）黄牛肌肉干细胞（MuSCs）的RNA-seq测序结果为基础，筛选出显著差异表达的circRNA,circCEP85L。采集新鲜黄牛胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、肠和胃的组织样本，分离培养黄牛肌肉干细胞并诱导成肌分化，收集黄牛体外培养的GM与DM细胞，分别提取RNA并反转录为cDNA。通过实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)检测circCEP85L在不同组织及不同细胞状态的表达规律。同时，设计特异性引物扩增circCEP85L全长，构建过表达载体p-circCEP85L，质粒转染MuSCs后收集过表达circCEP85L细胞样本。以过表达质粒pCD5-ciR细胞样本为对照，采用qRT-PCR、流式细胞术、Western Blot及免疫荧光等技术检测过...     

多杀性巴氏杆菌免疫逃避机制

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起多种畜禽巴氏杆菌病,严重影响养殖业发展。该菌为了能在宿主体内建立感染,已具备了多样化的和复杂的策略来逃避宿主的免疫应答。已发现的多杀性巴氏杆菌的免疫逃避机制包括干扰或逃避宿主的吞噬作用,抵抗中性粒细胞、抗菌肽、补体介导的杀伤作用,降解免疫球蛋白或封闭抗体活性,形成生物膜等,除此之外,多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)还参与多种免疫逃避活动。本文就针对多杀性巴氏杆菌的免疫逃避机制做一综述。     

水牛Sox2基因原核表达载体的构建与诱导表达

水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要,它是重要的多能性干细胞(iPS细胞)标记基因之一,试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2,将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a(+),成功构建了原核表达载体pET-Sox2,然后利用IPTG诱导,获得诱导表达蛋白,并经过SDS-PAGE电泳分析和Wes...     

不同逆转录载体系统应用于水牛胎儿成纤维细胞转基因的探索

采用2种不同的逆转录病毒载体系统（pMX和pMSCV）,构建携带绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组载体,探索能高效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFFs）的病毒系统和感染方法.结果发现,2种逆转录病毒系统包装出的重组病毒滴度都能达到10⁶,将pMX病毒系统生产的重组病毒经超速离心浓缩后,滴度可达到10⁷;2种重组病毒都能感染BFFs,但pMX系统比pMSCV系统更能有效地感染BFFs;通过对病毒的感染方式进行比较,发现使用新鲜病毒连续感染BFFs 2次（每次间隔12 h）,或者经过超速离心浓缩后的病毒感染BFFs 1次,可以显著提高感染效率.     

水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列（Oct4：NM_174580,Nanog：NM_001025344）设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列（the coding sequences,CDS）和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,Nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFFs）,逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12—15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;Nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和Nanog基因能转入BFFs中,在mRNA水平和蛋白水平都表达,阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全长和CDS,其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守;逆转录病毒转基因方法将Oct4和Nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。     

水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段（shEGFP）对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1（或CACCC盒）及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组（P＜0.05）,而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著（P＞0.05）.[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.     

家畜脂肪干细胞研究进展

脂肪组织中含有大量的间充质干细胞,目前对于间充质干细胞的研究主要是关注其基本的生物学特性和临床应用方面。脂肪干细胞因具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性,且有易获取、安全、可迅速扩增等特点,已成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。利用脂肪干细胞建立大动物模型,以研究人类疾病、异体器官移植、动物疾病治疗和组织修复等方面,已成为脂肪干细胞的一个研究趋势。本文将对家畜脂肪干细胞的分离培养、表面抗原鉴定、分化能力、应用前景及存在问题做一综述。     

水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10⁶TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。     

水牛iPS细胞转录因子Sox2及协助蛋白HA2-TAT的原核表达

为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,本试验对水牛iPS细胞转录因子Sox2与细胞穿膜肽HIV TAT进行融合表达,以获得具有自主穿膜功能的Sox2蛋白,建立非转基因水牛iPS生产技术体系。首先人工合成了HA2-TAT序列,并将pET-32a（＋）质粒改造为pET-HA2-TAT基础表达载体,再通过双酶切定向克隆将水牛Sox2基因插入pET-HA2-TAT得到原核表达载体pET-NLS-Sox2-TAT;重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测融合蛋白表达,再用Ni 2＋柱进行纯化融合蛋白。结果表明,成功表达了融合蛋白HA2-TAT（24 400）和NLS-Sox2-TAT（57 700）;纯化蛋白NLS-Sox2-TAT在咪唑浓度为365.30mmol/L时,出现蛋白洗脱峰,经Western blot验证表达的融合蛋白具有免疫原性。