棉花皱缩花叶病的初步研究

2007年湖北荆州地区一些棉田棉花叶片上发生一种新的棉花病害,暂定名为棉花皱缩花叶病。通过症状描述、电镜观察和生物学接种对其进行了初步分析。结果显示:该病害症状疑似病毒病,但与已经报道的棉花病毒病症状都不相同。电镜观察显示,病株叶片汁液中存在4种杆状病毒颗粒,大小分别约是18nm×300nm、18nm×500nm、18nm×800nm、18nm×1100nm。生物学接种结果表明,该病不能经种子、棉蚜、烟粉虱、汁液摩擦4种方式传播。     

植物病毒RNA间重组的研究现状

根据近几年来研究的最新资料，从植物病毒ＲＮＡ间的重组位点的特征以及重组体亲本链双方的来源的角度对植物病毒ＲＮＡ的重组类型作了介绍，并对其重组机制作了综述。     

稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的快速克隆(英文)

本文描述了一种简便而有效的克隆基因未知５＇和３＇末端序列的方法，并用此方法克隆了稻瘟病菌的３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）．即通过比较１２种真菌的已知ｇｐｄ基因序列，寻找内部的保守区段，设计并合成一对特异性引物．引物Ｐ１为靠近基因５＇端的一个特异性序列，引物Ｐ２则与３＇端的一段特异性序列互补．以双链ｃＤＮＡ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体连接物为模板，利用基因的特异性引物Ｐ１和载体上的标准测序引物Ｔ７，ＰＣＲ扩增出包含ｃＤＮＡ３＇末端的序列；利用特异性引物Ｐ２和标准测序引物Ｔ３，扩增出包含ｃＤＮＡ５＇末端的序列．将两片段分别克隆、测序和合并后，得到全长１０１１ｂｐ的稻瘟病菌３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）的编码区序列．该序列及其相应的氨基酸序列与已知真菌的ｇｐｄ基因序列有着６１．４％－８６．６％和６４．６％－８６．３％的同源性．特别在酶的活性功能区不同真菌间有着近乎相同的氨基酸序列．     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料，采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术，经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线，最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处，最小紫外吸收值为２４０ｎｍ，Ａ２６０／２８０＝１．６８，病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清，所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定，其效价为１／１０２４，且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

水稻条纹病毒外壳蛋白和病害特异蛋白在寄主体内的积累

ＰＡＳ ＥＬＩＳＡ检测结果表明：（１）水稻条纹病毒外壳蛋白和病害特异蛋白在水稻寄主体内累积量的变化趋势是一致的，而且均与寄主症状的严重度密切相关．（２）不同水稻品种中，２种蛋白的累积量和累积速率有明显差异．明恢６３（高感）２种蛋白的累积量均比ＩＲ３６（高抗）的明显大；０６３８１（耐受性低）２种蛋白的累积速率均比岗优２２（耐受性高）的明显快，０６３８１病叶中２种蛋白累积量在其显症３０ｄ左右达到高峰，而岗优２２的则在４０ｄ左右     

水稻细菌性条斑病菌胞外产物的性状

对水稻细菌性条斑病菌胞外产物（胞外多糖、蛋白酶、果胶酸酯裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、淀粉酶、半纤维素酶）的部分特性以及不同菌株离体产生各胞外产物能力与致病力的相关性进行了初步研究．发现病菌在离体条件下分泌的各胞外产物总量和单位产量随培养时间的增长而增加，至一定的阶段后趋于稳定．不同培养基下各胞外产物的产生有所变化，但对各菌株之间单位产量的差异影响不大．病菌产生的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、半纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶活性最适ｐＨ值分别为９．０、６．０、８．０、４．０、８．０．其蛋白酶活性与致病力呈显著正相关，果胶酸酯裂解酶与致病力呈正相关．病菌除去胞外产物后，降低了在水稻叶片上的吸咐和增殖能力．强致病力菌株胞外产物对离体稻叶的伤害能力要强于弱致病力菌株．     

应用Real-Time RT-PCR鉴定2个水稻品种(品系)对水稻条纹病毒的抗性差异

应用Real-time RT-PCR检测了水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)在2种水稻品种(品系)武育粳3号和KT95-418的悬浮细胞内复制变化和相对含量的差异,结合传统生物学接种试验,确定了这2个品种(品系)对RSV抗性的差异.结果表明,RSV在武育粳3号的悬浮细胞内24 h达到复制高峰,病毒含量为侵染初期的7.46倍.而在KT95-418的悬浮细胞内,RSV达到复制高峰需要36 h,病毒含量为侵染初期的4.51倍.利用病毒生物学接种的方法,武育粳3号发病率达91.7%,而KT95-418仅为36.0%.由此可见,KT95-418较武育粳3号对RSV具有较高的抗病性.因此,Real-time RT-PCR方法与传统生物学接种试验方法相比,具有更高的准确性和灵敏性,可以作为传统品种抗病性鉴定的验证手段.     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

应用A蛋白夹心酶联免疫吸附法鉴定黄瓜花叶病毒血清组

根据Ａ蛋白夹心酶联免疫吸附法（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）试验结果可以将我国分离的１６个黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）分离物及４个ＣＭＶ标准毒株（Ｆｎｙ、Ｌｎｙ、Ｍ、ＷＬ）区分为２个血清组．１４个分离物及标准毒株Ｆｎｙ、Ｍ属ＤＴＬ血清组，２个分离物及标准毒株Ｌｎｙ、ＷＬ属ＴｏＲＳ血清组