乙醇酸氧化酶基因诱导反义表达载体的构建与水稻的遗传转化

通过RT-PCR扩增得到水稻叶片乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase,GLO)的全长cDNA并构建诱导反义表达载体pER8-GLO,以根癌农杆菌介导法得到转基因水稻.以诱导剂β-雌二醇(β-estradiol)诱导处理12d后,转基因水稻的GLO活性降低超过80％.在空气条件下,转基因植株的生长受到抑制;而...     

水稻 OsPIN1b 基因 GFP 融合表达 载体构建及转化水稻的研究

水稻生长素输出载体OsPIN1a可能参与调控水稻根负向光性反应。为了进一步研究其他OsPIN基因与水稻根负向光性的关系,以GenBank数据库报道的OsPIN1b核苷酸序列为基础,设计特异引物以RTPCR从水稻cDNA中扩增得到OsPIN1b基因。测序结果表明获得完整的OsPIN1b基因ORF序列;生物信息学分析表明,OsPIN1b基因序列全长1 665 bp,与已报道的序列相吻合,其GC含量为64.08%,编码554个氨基酸。进一步构建了该基因的GFP融合表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1b∷GFP并转化水稻中花11,分子检测和GUS染色表明外源片段已经成功整合到水稻基因组,为研究OsPIN1b在水稻根负向光性中的作用奠定基础。     

集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶基因的克隆及其叶绿体定位分析

为明确集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶与水稻Rubisco小亚基叶绿体转运肽(RCTP)的融合蛋白是否能准确定位到水稻叶绿体,本研究以特异引物从集胞藻PCC6803基因组DNA中扩增获得约1.5 kb的片段,将该片段与水稻Rubisco小亚基叶绿体转运肽连接,然后将融合片段连入瞬时表达载体P322-d1-e GFP,测序,获得融合基因RCTP-gdh,进一步构建了叶绿体定位的瞬时表达载体RCTPGDH-e GFP-d1并进行了叶绿体定位研究。结果表明,集胞藻PCC6803 GDH共编码492个氨基酸,含有FAD结合域、FAD关联的氧化酶活性(222~464 aa)以及乙醇酸氧化酶亚基(51~463 aa)。激光共聚焦显微镜分析表明,融合蛋白RCTP-GDH-e GFP可以准确定位到水稻叶绿体,但其转运效率低于RCTP-e GFP的转运效率,叶绿体和细胞质中的融合蛋白RCTP-GDH-e GFP都易于聚集而呈斑点状。本研究为进一步应用集胞藻gdh基因改造C3作物光呼吸代谢途径,抑制C3作物光呼吸速率,提高作物光合速率奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

【目的】生长素输出载体蛋白（PIN-FORMED,PIN）是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据。【方法】根据OsPIN9序列设计特异性编辑位点,构建OsPIN9编辑载体,以日本晴愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法获得抗性植株,通过PCR鉴定转基因植株。转基因植株通过PCR和测序明确OsPIN9的突变类型,获得ospin9纯合突变体并分析突变蛋白与野生型蛋白的差异。qRT-PCR分析突变体幼苗根部OsPINs的表达,进一步明确突变体与野生型对照植株之间的表型差异。以0.05 μmol·L^-1的萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid,NAA）处理幼苗7 d,分析NAA对植株表型的影响。【结果】在水稻OsPIN9第1外显子处设计靶点并构建表达载体,通过遗传转化成功获得18株T₀代转基因植株,测序分析发现转基因株系中有3种不同的突变方式,均为在靶位点的18位碱基处插入不同的单碱基,其中,3株插入T碱基,3株插入G碱基,1株插入C碱基,共获得基因编辑株系7株,进一步鉴定获得2种纯合突变体。序列比对分析表明,这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的426个氨基酸缩短为172个氨基酸,跨膜螺旋结构域分析表明突变体中OsPIN9蛋白的跨膜结构完全消失。qRT-PCR分析表明,2个突变株系的OsPIN9转录水平显著降低,OsPIN1a和OsPIN5b表达上调,而OsPIN5a表达受到抑制。幼苗期的表型分析表明,突变体的株高显著低于野生型,不定根数显著少于野生型,但根长没有显著变化。NAA处理下,植株的生长受到抑制,ospin9突变体的不定根数仍少于野生型,但差异已不显著。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻生长素输出载体蛋白OsPIN9进行定向编辑,可获得无转基因成分的基因编辑植株,OsPIN9的突变影响其他OsPINs的表达,ospin9突变体的地上部和地下部的发育都受到抑制,NAA处理能部分恢复突变体不定根的发育。     

利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用

【目的】FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因。为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体。同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米B104为材料,克隆ZmFKF1,通过序列比对明确ZmFKF1的基因结构。以ZmFKF1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶点,将设计的靶点序列在玉米参考基因组中进行比对分析,排除非特异性靶位点,最终筛选出在ZmFKF1第1外显子上的靶位点ZmFKF1-T1,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。利用农杆菌介导法,转化玉米B104幼胚,通过抗性筛选获得抗性愈伤组织,之后诱导出芽和生根,获得T₀代ZmFKF1编辑阳性植株,并利用cas9特异引物进行验证。利用靶位点扩增测序法,明确T₁代ZmFKF1编辑植株在ZmFKF1预期靶标位点是否发生突变及突变的类型,筛选获得ZmFKF1定点突变纯合株系。获得这些材料后,以野生型B104为对照,统计和分析开花表型。同时,利用实时荧光定量PCR技术检测上述材料中与玉米开花途径相关的关键基因的表达量变化,对表型进行进一步的验证。【结果】在玉米FKF1的第1外显子上设计靶点构建基因编辑表达载体,通过遗传转化获得的转基因株系实现了对ZmFKF1的定点突变,共获得T₀代ZmFKF1编辑阳性株系18株,在预期靶标位点上发生突变的有6株,2种不同的突变类型：单碱基插入和多碱基缺失。通过开花时间统计和分析,与野生型B104相较,3个T₂代ZmFKF1编辑纯合突变体的开花时间延迟,显著（P＜0.05）晚于B104。进一步对这些材料中的开花关键基因ZmGI、conz1和ZmZCN8进行表达量检测,发现突变体中这些基因的表达明显（P＜0.05）低于野生型B104,与晚花表型相符。【结论】可利用CRISPR-Cas9技术对ZmFKF1进行定点编辑获得基因编辑突变体,且突变体开花时间明显延迟。     

小麦返白系相关基因的克隆与表达

为研究小麦返白系阶段性“白化-复绿”的分子机制,以中国春小麦叶绿体基因组序列的LSC区为参考序列,分段设计引物,PCR扩增中国春、矮变1号、返白系的相应基因片段,在返白系中获得特异基因片段WFC01.提取中国春、矮变1号幼嫩叶片和返白系白化及复绿叶片总RNA,毛细管法转膜,WFC01为探针进行Northern杂交.结果表明,与对照矮变1号和中国春相比,返白系随着叶片的白化,WFC01基因片段的表达受到明显抑制,几乎无表达,随着叶片的复绿,WFC01基因片段的表达恢复正常,与对照表达量一致,表明该基因的表达与返白系的阶段性白化、复绿有关.     

纳米硅对Cd胁迫下水稻幼苗γ-ECS基因表达的影响

为了探明外源纳米硅对缓解植物Cd毒害的分子机制,本文以核基因延伸因子(EF-/α)作为内参,利用半定量反转录聚合酶链式反应技术,对Cd胁迫下的水稻γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)基因的表达进行了研究.结果发现:γ-ECS基因在水稻的叶、根中均表达,外源纳米硅不同时间处理后水稻叶片和根中γ-ECS基因的表达稍微有所增强.研究表明,用半定量RT-PCR技术研究水稻基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点.     

防腐剂结合蜡处理对沙糖桔贮藏保鲜效果的影响研究

以无核沙糖桔果实为材料,研究了多菌灵、施保功及特克多与2,4-D、果蜡等组合的防腐保鲜剂配方对常温贮藏果实好果率和品质的影响。结果表明,稀释蜡液处理以0.010%2,4-D 0.025%特克多 0.50%蜡液的效果最好,贮后60 d的好果率为95.0%;果蜡原液处理以0.010%2,4-D 0.100%施保功 果蜡原液的效果最好,贮后60 d的好果率为95.3%。研究结果还表明,2种防腐保鲜剂配方能有效地保持沙糖桔果汁可溶性固形物、维生素C和可滴定酸的含量,减少果实的失重。     

中华枸杞叶片离体再生技术初探

为探索中华枸杞(Lycium chinense Mill.var.chinense)叶片离体再生技术,通过设置不同消毒时间梯度,研究了0.1%升汞溶液对中华枸杞叶片的消毒效果;以MS为基本培养基,添加6-BA、2,4-D、IAA等激素,研究了不同激素浓度配比对中华枸杞叶片离体再生的影响。结果表明,用0.1%升汞溶液消毒叶片8 min,污染率最低,是中华枸杞叶片的最佳消毒时间。基本培养基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L2,4-D是诱导愈伤组织的最佳激素浓度配比;基本培养基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是诱导愈伤组织分化的最佳激素浓度配比;基本培养基中添加0.2 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA是诱导丛生芽生根的适宜激素浓度配比。利用组织培养技术可有效实现中华枸杞叶片离体再生和快速繁殖,为其工厂化育苗和优良品种的选育奠定基础。     

水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻（Oryza sativa）中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。