我国林业科技发展建设研究

分析了林业科技工作发展现状和存在的问题,提出着力建设人才和队伍,加大资金扶持力度,加强宣传等对策。     

二倍体和四倍体泥鳅全基因组DNA甲基化的比较

以二倍体和四倍体泥鳅为研究对象,采用甲基化修饰依赖性内切酶测序技术(MethylRAD-Seq)在全基因组水平上分析泥鳅的DNA甲基化特点及倍性间的DNA甲基化变异。测序结果共得到302 111 684条Methyl-RAD序列标签。与参考基因组比对结果显示,泥鳅的甲基化位点主要分布在基因体区(gene body),其次为内含子区(intron)和基因间区(intergenic),而在其他功能元件上的分布较少。四倍体泥鳅的整体甲基化水平比二倍体高,尤其是在第一外显子区(1st Exon)和转录起始位点上游1 500bp至200bp区(TSS1500),且倍性间差异极显著(P0.01)。但在启动子区,四倍体泥鳅的甲基化水平略低于二倍体。在二倍体和四倍体泥鳅间共筛选到1 268个差异甲基化CmCGG位点和14个差异甲基化CmCWGG位点,这些位点主要分布于内含子、基因体和基因间区。比较各基因的甲基化水平,共得到684个倍性间差异甲基化基因。KEGG分析结果显示,倍性间差异甲基化基因主要富集到与生长发育、免疫及错配修复等相关通路上。     

泥鳅cyp19a1基因克隆及其在倍性间的表达差异

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量用于个体生长。由于cyp19a1及其催化产生的雌激素还可以通过GH-IGF通路调节鱼类的生长,推测cyp19a1在泥鳅倍性间的差异表达可能与二倍体、四倍体间的生长生殖差异密切相关。     

二倍体和四倍体泥鳅IGFBP-1基因的表达及其与DNA甲基化的相关性

为探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因在二倍体和四倍体泥鳅之间的表达差异及其与DNA甲基化的相关性,克隆二倍体、四倍体泥鳅的CDS序列和启动子序列,并分别采用qRT-PCR和亚硫酸氢盐测序技术(BSP)分析IGFBP-1在二倍体、四倍体泥鳅中的表达水平及启动子区和第一外显子区的甲基化水平。结果显示,泥鳅的IGFBP-1基因CDS序列长789bp,编码262个氨基酸,二倍体、四倍体泥鳅间有5bp的差异,但氨基酸序列完全相同。在二倍体、四倍体中分别克隆得到2 341bp和2 331bp的启动子序列,倍性间的序列相似度达99%,启动子序列中包含典型元件TATA-box,以及SP1、CREB、C/EBP、POU2F2、GATA-2/3/4和SRY等转录因子结合位点。泥鳅的IGFBP-1基因主要在肝脏中表达,且四倍体泥鳅肝脏中IGFBP-1的表达水平显著高于二倍体(P0.01)。四倍体泥鳅IGFBP-1基因启动子及第一外显子区的甲基化水平均比二倍体低,其中四倍体肝脏中的甲基化水平显著低于二倍体(P0.01)。综合分析研究结果表明,在IGFBP-1基因主要表达的肝脏组织中,其mRNA表达水平与DNA甲基化水平呈负相关,启动子区较高的甲基化可能抑制了二倍体泥鳅IGFBP-1基因的表达。     

二倍体和四倍体泥鳅qRT-PCR分析中内参基因优选

为筛选在泥鳅中稳定表达的内参基因,以确保泥鳅基因表达分析结果的可靠性,选取ACTB、TUBA、EF1A、GAPDH、TUBB和18SrRNA 6个常用的内参基因作为候选内参基因,分别用BestKeeper、geNorm、NormFinder、ΔCt和RefFinfer软件分析这6个基因在二倍体和四倍体泥鳅胚胎发育阶段、成鱼组织间以及倍性间表达的稳定性。结果显示,在胚胎发育各阶段,TUBB和TUBA的表达最稳定,可作为胚胎发育阶段qRT-PCR分析的内参基因;其中,TUBB在泥鳅倍性间的表达差异不显著,因此,可作为泥鳅胚胎发育中跨倍性qRT-PCR研究的内参基因。在成鱼各组织中,ACTB和18SrRNA的表达最稳定,可用作组织间qRTPCR分析的内参基因;其中,18SrRNA在倍性间的组织表达差异不显著,因此,可作为泥鳅组织间跨倍性qRTPCR的内参基因。