环状RNA及其在生殖发育中的研究进展

环状RNA（circular RNA，circ-RNA）是一类由初始转录RNA反向剪接，形成的闭合环状RNA分子，广泛存在于真核细胞中。因不受RNA外切酶切割，所以稳定存在时间长。主要通过海绵吸附作用竞争性结合miRNA调节基因表达。circ-RNA分子鉴定及其生理调控作用成为近几年生命科学领域的研究热点，本文从circ-RNA的生成过程、在早期胚胎发育调控以及配子发育过程中的数量和作用等方面进行了综述。     

水通道蛋白在调节肠道健康中的作用

水通道蛋白是一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白,广泛分布于人和哺乳动物的胃肠道组织中,在机体液体转运和消化生理中发挥重要作用。本文总结了水通道蛋白的结构、分类及其在人、鼠类和仔猪胃肠道系统的表达和分布情况,并阐述了水通道蛋白与腹泻、肠上皮细胞迁移与修复、肠道屏障功能和肠道炎症相关疾病等过程的关系及其作用。     

猪精原干细胞体外培养条件的优化

以出生后1～5 d的长白公猪为主要研究对象,采用两步酶消化法获取睾丸细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法对猪精原干细胞(PSSCs)进行纯化,以碱性磷酸酶(AP)染色鉴定;利用MTT法检测2种细胞因子——胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对PSSCs发育的影响.结果表明:用Percoll不连续密度梯度法获得的PSSCs占睾丸总细胞数的(8.19±0.83)%,AP染色的阳性率为(87.47±2.90)%,表明该方法可有效获取PSSCs;MTT法检测表明,20 ng.mL-1 GDNF+1 000 U.mL-1 LIF的组合添加对PSSCs体外增殖的效果最好.     

小鼠精原干细胞分离培养条件的优化

采用两步酶消化法获得5～7日龄昆明小鼠睾丸组织的单细胞悬液,比较差速贴壁法和Percoll不连续密度梯度法对精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)的纯化效果,并利用MTT法检测不同生长因子及添加浓度对SSCs体外增殖的影响.结果表明5日龄小鼠和7日龄小鼠的睾丸细胞总数存在较大差异(P<0.05),但SSCs数目无显著差异(P>0.05);与Percoll不连续密度梯度法相比,差速贴壁法获得了较高的SSCs数量和纯化率,其纯化率平均85.06%;MTT法检测结果表明LIF因子的添加对SSCs的增殖具有促进作用,20 ng/mL GDNF+20 ng/mLbFGF+103 U/mL LIF的组合添加是昆明小鼠SSCs的体外培养增殖的最佳组合.     

左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响

【目的】探讨不同质量浓度的左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响.【方法】在成熟培养液中添加不同质量浓度左旋肉碱,观察其对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,并利用油红染色、三酰甘油定量试剂盒和定量RT-PCR技术检测其对卵母细胞脂肪代谢及其关键水解酶表达水平的影响.【结果和结论】在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉碱能极显著促进猪卵母细胞的脂肪滴代谢(P0.001),并显著提高猪卵母细胞体外成熟率和孤雌激活囊胚发育率(P0.05);在胚胎培养液中添加100 ng/mL左旋肉碱能够显著提高猪孤雌胚胎卵裂率(P0.05),其囊胚率和囊胚质量均有提高的趋势;通过定量RT-PCR进一步发现100 ng/mL左旋肉碱极显著降低猪卵母细胞中激素敏感脂肪酶基因(HSL,P0.01)和三酰甘油水解酶基因(ATGL,P0.001)的mRNA表达水平,表明左旋肉碱能够影响调控脂肪代谢关键酶基因的表达.试验结果表明,左旋肉碱具有促进猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的作用,其可能是通过调控脂肪代谢来实现的.     

外泌体microRNA在猪成熟和闭锁卵泡中的表达差异及功能分析

【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。     

玉屏风散总多糖对小鼠派氏结淋巴细胞活化及功能影响的研究

通过研究玉屏风散总多糖对体外培养小鼠派氏结(Peyer's patches,PPs)淋巴细胞活化和功能变化的影响,探讨其对小鼠肠黏膜免疫应答的作用机制。体外培养小鼠PPs淋巴细胞,MTT法检测PPs淋巴细胞加入Con A协同不同浓度玉屏风散总多糖(0. 5、1、2、4、8 mg/m L)在作用不同时间(0、8、12、16、24、36 h)后的增殖变化; ELISA试剂盒检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的含量变化;流式细胞术研究PPs淋巴细胞中T、B淋巴细胞的比例变化,进行T淋巴细胞的亚群分析。结果发现,不同浓度的玉屏风散总多糖均能增强PPs淋巴细胞的活性,单独作用时,浓度达到1 mg/m L以上,差异极显著(P 0. 01);与Con A刺激组比较,Con A与玉屏风散总多糖协同作用时,浓度达到2 mg/m L以上差异极显著(P 0. 01),且对PPs淋巴细胞增殖活化有明显促进作用(P 0. 01)。同时,玉屏风散总多糖可明显促进小鼠PPs淋巴细胞产生和分泌IL-2、IL-4、IFN-γ,改变PPs淋巴细胞中T、B淋巴细胞的比值,且可显著提高CD4+/CD8+的比值。结果表明,玉屏风散总多糖能显著提高小鼠PPs淋巴细胞活性,增强肠黏膜免疫功能。     

猫血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

【目的】 在毕赤酵母中构建猫血清白蛋白（feline serum albumin,FSA）表达系统,并探索其最适的基本表达条件,为FSA的生产提供一种新方法。【方法】 在GenBank上获取FSA碱基序列,进行密码子优化并合成,将优化的密码子构建到载体pPIC9K上,经PCR和双酶切验证后通过电击转化将重组质粒FSA-pPIC9K转化毕赤酵母GS115,依次经MD平板和G418筛选后进行菌落PCR获得阳性菌株,随机选取阳性菌株经甲醇诱导表达96 h后,取表达上清液进行Western blotting验证。选取表达量较高的菌株分别在不同温度（24、26、28和30 ℃）、pH （4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）和甲醇诱导量（其中1组为每24 h添加0.5%,其余4组为每12 h分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的条件下诱导表达96 h,取表达上清液进行Western blotting验证。【结果】 菌落PCR结果显示,获得2条大小分别约为2.3和2.2 kb的目的基因条带和毕赤酵母AOX1基因扩增条带,诱导表达96 h后取表达上清液进行Western blotting验证,在70 ku左右出现特异性条带。通过基本条件优化发现该蛋白在28 ℃,pH为6.0且每12 h添加0.5%的甲醇条件下表达量较高。【结论】 毕赤酵母GS115可稳定表达FSA。     

α-酮戊二酸二甲酯预处理对犬脂肪间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

研究旨在探究α-酮戊二酸二甲酯(dimethyl α-ketoglutarate,DMKG)预处理对犬脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)抗氧化应激损伤的影响。以含0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L过氧化氢(H₂O₂)的DMEM/F12基础培养基处理犬ADSCs,1 h后采用CCK-8法检测细胞存活率,筛选最适浓度以建立犬ADSCs氧化应激模型。选取生长良好的P3代犬ADSCs分为3组,分别为空白对照组、模型组、DMKG组。空白对照组正常培养,不作处理;模型组使用最佳浓度的H₂O₂溶液处理犬ADSCs 1 h;DMKG组使用1 mmol/L DMKG预处理犬ADSCs 24 h后,使用最佳浓度的H₂O₂溶液处理犬ADSCs 1 h。培养结束后,采用CCK-8法检测各组的细胞存活率,可见分光光度法检测还原型谷胱甘肽含量,荧光探针DCFH-DA检测活性氧水平,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、抗凋亡相关基因Bcl-2和促凋亡相关基因Bax、Cleaved-Caspase3的mRNA表达水平。结果显示,与模型组相比,DMKG预处理能有效减少细胞内活性氧的产生(P<0.05),增加细胞存活率(P<0.01),并抑制细胞凋亡(P<0.05);同时,DMKG预处理可增加还原型谷胱甘肽含量(P<0.01),上调相关抗氧化酶基因SOD1、SOD2(P<0.01)和CAT(P<0.05),下调凋亡基因Cleaved-Caspase3的表达水平(P<0.05),增加Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。综上所述,DMKG预处理可显著提高犬ADSCs抗氧化、抗凋亡的能力,从而增加犬ADSCs在氧化应激条件下的存活。     

外泌体miRNA在配子发育和受精中的调控作用

外泌体(Exosomes,EXs)是一类膜状结构的纳米级细胞外囊泡,携带大量的生物活性调节分子进行细胞间信息转导。EXs携带的miRNA在配子发生、发育和受精过程中发挥重要的调控作用。本文主要对EXs中的miRNA在卵母细胞和精子成熟以及受精过程中的调控作用做一综述。