GOX-CP4EPSP转化甘蓝型油菜的抗草甘膦研究

利用Genome walking方法在孟山都抗农达油菜(Brassica napus L.)中克隆了GOX-CP4EPSP双顺反子结构。利用农杆菌介导的遗传转化方法将PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物双元表达载体转化甘蓝型油菜Pol CMS恢复系"7-5"获得转基因植株。在田间对转基因植株喷施400倍的农达(41%草甘膦异丙胺盐),所有的转基因家系都能存活,而非转基因Pol CMS恢复系"7-5"全部死亡。在转基因植株叶片中能够检测到GOX和CP4EPSP基因的表达。对转基因T1代3个家系在60 mg/L草甘膦培养基上的发芽试验以及GUS染色分析表明抗草甘膦的单株能表达与GOX-CP4EPSP共转化的GUS蛋白质,而对草甘膦敏感的单株和野生型对照植株都不能表达GUS蛋白质。鉴于GOX-CP4EPSP双顺反子在转基因油菜中的有效性和稳定性,可以作为双子叶植物遗传转化的筛选标记。     

甘蓝型油菜细胞隐性核雄性不育上位抑制基因 （esp）的分子标记开发

9012AB是甘蓝型油菜隐性上位细胞核雄性不育两型系，其育性受2对隐性重叠不育基因（ms3ms3ms4ms4）和1对隐性上位抑制基因（espesp）互作控制。为提高其不育系及同型临保系的选育效率，本研究以9012B和T45为基本材料，构建分离群体，鉴定与esp基因紧密连锁的AFLP标记。筛选了1 024对引物组合，鉴定出5个与esp相引相连锁的AFLP标记（L1、L2、L3、L4和L5），2个与esp相斥相连锁的AFLP标记（L6和L7）。所有标记位于esp位点的一侧，L6和L7与Esp基因共分离。其中，L1、L6和L7转化成SCAR标记SCL1、SCL2和WSCL3。在20个基因型已知的验证群体中检测，SCL1、SCL2和WSCL3的准确率分别为90%、100%和100%。结果表明三个SCAR标记可用于9012AB的分子标记辅助选择。     

BnA7HSP70分子伴侣结合蛋白超表达能够提高甘蓝型油菜耐旱性

分子伴侣结合蛋白广泛参与植物生长发育过程,在逆境下能够保护植物细胞免受胁迫。在甘蓝型油菜中超表达油菜含有HSP70热激蛋白结构域的分子伴侣基因BnA7HSP70,所得到的转基因植株在缺水条件下延缓萎蔫。通过生理生化实验证明,干旱条件下转基因植株有着更高的相对含水量、更强的渗透调节能力和较低的脂质膜过氧化性。另外,转基因植株的幼苗在萌发期表现出对糖基化酶抑制剂衣霉素处理的耐受性。Evans blue染色实验证明,转基因植株逆境下叶片死亡细胞数目比非转基因植株减少,叶片衰老相关标记基因Bn CNX1在转基因植株中下调表达证明,超表达BnA7HSP70基因所介导的途径能够减轻逆境胁迫下的植株衰老,保持叶片持绿性。在转基因植株中内质网和渗透胁迫产生的细胞死亡标记基因N-Rich蛋白Bn NRP延迟表达证明,在油菜中增强BnA7HSP70基因的表达能够缓解未折叠蛋白途径(unfold protein response,UPR)和NRP(N-rich pathway)途径介导的叶片黄萎,并降低油菜叶片失绿的标记基因BnLSC222和BnLSC54的表达。研究结果表明,在油菜中超表达BnA7HSP70基因能够提高植株在干旱条件下内质网胁迫的耐受性。     

单倍体诱导创建二倍体技术在油菜遗传育种中的研究进展

单倍体诱导创建二倍体的技术体系主要包括2种类型。(1)对植物中雄性或者雌性生殖器官进行培养获得具有单套染色体组的组织,经过天然或者加倍剂处理获得二倍体;(2)对CENH3基因进行修饰获得单倍体诱导系,利用单倍体诱导系与不同材料杂交获得后者的单倍体,进而加倍成二倍体。在油菜中应用最广泛的单倍体诱导创建二倍体植株的技术是小孢子培养方法,其过程受到3个因素的影响,分别为小孢子胚发生能力、小孢子天然加倍和加倍剂处理后的加倍效率、从胚再生成完整植株的能力。经过多年研究,在油菜中建立的小孢子诱导创建二倍体的技术为油菜遗传育种研究提供了重要的技术支持。小孢子和小孢子培养得到的胚均能用于创造突变体及遗传转化试验。通过遗传学方法定位了决定油菜小孢子胚发生、天然加倍以及胚状体直接成苗的数量性状基因座(QTLs),可在不同群体中验证候选基因。深入挖掘调控小孢子胚发生和再生成苗的分子机制,分析胚性细胞发育的转变、起始细胞的分化以及胚形态发生的基因调控网络,进而为理解油菜单倍体诱导以及二倍体发生的作用机制提供依据。随着植物单倍体诱导发生的分子机制被逐步揭示,在油菜中对与拟南芥染色体减数分裂相关的同源基因进行修饰能够获得单倍体诱导系,将其与待改良的父母本进行杂交可快速获得具有不同亲本背景的单倍体,经过加倍剂处理可快速获得纯系,单倍体诱导技术能够用于反向育种研究以及品种的遗传改良。     

甘蓝型油菜新品系的抗裂角性筛选与相关性状分析

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的裂角落粒严重影响油菜的产量和机械适收性。利用改进后的随机碰撞法对122份甘蓝型油菜的自交系和杂交组合进行抗裂角性评价,发现抗裂角指数(Shatter resistant index,SRI)大于0.60的品系占4.1%。分析抗裂角指数(SRI)与角果长、宽、果喙的相关性,发现抗裂角指数与角果长和果皮厚呈极显著正相关,且相关系数较高。结合种子的品质性状分析,共筛选了3份品质性状优良且抗裂角性强的甘蓝型油菜新品系早熟圣光168、E-7039和E-7089。     

甘蓝型油菜杂交种圣光168父本根肿病抗性的遗传改良与应用

为培育优良的抗根肿病油菜品种,以华双5R和华油杂62R（分别携带抗根肿病位点PbBa8.1和CRb）为供体亲本,以圣光168的父本Y522R为轮回亲本,通过回交与分子辅助育种相结合,将PbBa8.1和CRb导入到Y522R中,选育出遗传背景回复率均达90%以上,且分别携带PbBa8.1、CRb和PbBa8.1+CRb抗病位点的近等基因系Y522R ^PbBa8.1 、Y522R ^CRb 、Y522R ^PbBa8.1+CRb,并在此基础上与圣光168母本RG430A配制了具有根肿病抗性的改良杂交种圣光168CR ^PbBa8.1 、圣光168CR ^CRb 和圣光168CR ^PbBa8.1+CRb。利用我国根肿菌4号优势生理小种,对改良株系及杂交种进行苗期根肿病抗性鉴定,结果表明：Y522R ^PbBa8.1+CRb 和Y522R ^CRb 改良株系及其改良杂交种圣光168CR ^CRb 和圣光168CR ^PbBa8.1+CRb 对4号生理小种具有免疫抗性;Y522R ^PbBa8.1 改良株系及其改良杂交种圣光168CR ^PbBa8.1 对4号生理小种表现为感病,但显著低于对照Y522R及圣光168。农艺性状考察结果表明,Y522R改良株系及其改良杂交种的开花期、株高、有效分枝数、角果长、每角果粒数和千粒重都与对照无显著性差异,说明这些改良杂交种可作为重要的抗根肿病油菜资源。     

转Bt基因油菜的抗虫性分析

利用农杆菌介导的遗传转化分别将Cry1C和Cry2A的2个单价Bt基因转入油菜(Brassica napus L.),以两个纯合的转基因抗虫油菜为亲本,通过有性杂交的方法将不同Bt基因聚合,培育双价Bt抗虫油菜,并对其抗虫性和种子品质性状进行评价。结果表明,Cry1C、Cry2A在聚合后均能稳定表达,和单价Cry1C转基因植株相比,双价株系中蛋白质含量明显降低,以Cry2A为母本的聚合株系蛋白质含量降低更多,Cry1C在遗传上存在母本效应。室内接种小菜蛾二龄幼虫结果显示,转化单价和双价聚合Bt基因的抗虫性增强,其中转化单价Cry1C的抗虫性优于双价聚合Bt基因和单价Cry2A基因的转基因植株。玻璃温室栽培转基因植株,单价Bt和双价聚合Bt基因的转基因植株能生存而非转基因植株受到严重虫害而死亡。对抗性优良的单价和双价聚合的转基因植株种子品质测定发现,与未受到虫害的受体材料双低优良恢复系7-5的含油量和硫苷含量差异不显著,从而达到抗性改良的目的。     

甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因(esp)的分子标记开发

9012AB是甘蓝型油菜隐性上位细胞核雄性不育两型系,其育性受2对隐性重叠不育基因(ms3ms3ms4ms4)和1对隐性上位抑制基因(espesp)互作控制。为提高其不育系及同型临保系的选育效率,本研究以9012B和T45为基本材料,构建分离群体,鉴定与esp基因紧密连锁的AFLP标记。筛选了1 024对引物组合,鉴定出5个与esp相引相连锁的AFLP标记(L1、L2、L3、L4和L5),2个与esp相斥相连锁的AFLP标记(L6和L7)。所有标记位于esp位点的一侧,L6和L7与Esp基因共分离。其中,L1、L6和L7转化成SCAR标记SCL1、SCL2和WSCL3。在20个基因型已知的验证群体中检测,SCL1、SCL2和WSCL3的准确率分别为90%、100%和100%。结果表明三个SCAR标记可用于9012AB的分子标记辅助选择。     

甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及抗性鉴定

为自主研发抗除草剂的甘蓝型油菜,从细菌（Isotericola variabilis）中克隆I.variabilis-EPSPS*基因,使油菜产生草甘膦抗性。通过农杆菌介导法将I.variabilis-EPSPS*转入甘蓝型油菜自交系育127,获得转I.variabilis-EPSPS*基因单株E₁。草甘膦耐受性结果表明,转I.variabilis-EPSPS*基因T₁代在不同浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,而非转基因对照生长严重受阻。I.variabilis-EPSPS*成功整合于油菜基因组并可稳定遗传,草甘膦处理后表达量增加,而且在草甘膦浓度改变时仍保持稳定表达。在温室用41%草甘膦异丙胺盐商品制剂（农达）600倍稀释液（1/3田间生产推荐中剂量）处理转I.variabilis-EPSPS*基因E₁的T₁植株,体内莽草酸累计量远低于非转基因对照。通过对角果长、每角果粒数和千粒重等农艺性状考察发现,转基因植株和对照相比无显著性差异。田间喷施农达400倍液（1/2田间生产推荐中剂量）,发现转基因E₁T₁植株正常生长而对照全部死亡。鉴于I.variabilis-EPSPS*基因在转基因油菜中能够稳定遗传并赋予了油菜草甘膦除草剂抗性,认为该抗草甘膦转基因油菜是一份新种质。     

侧翼序列克隆方法评价

克隆已知序列的侧翼DNA区域是基因操作实验中经常面临的任务之一。自PCR技术发明以来,以其为基础克隆侧翼序列的方法不断开发,如反向PCR(inversePCR)、捕捉PCR(capturePCR)、VectorettePCR、抑制PCR(suppressionPCR)、T接头PCR(T-linkerPCR)、多功能接头PCR(versatilecassettePCR)、AluPCR、热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)和DNA步行—复性控制引物(DNAwalking-an-nealingcontrolprimerTM)等。本文对上述方法的原理进行了简要的概括和总结,据此将其归为三大策略,即连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR。对不同的策略和同一策略中不同的方法的优缺点亦进行了比较,进而讨论和展望了它们的主要应用领域和潜力,以期对实际操作起到借鉴作用。