蓝光对龙眼细胞培养及类黄酮代谢的影响

采用搅拌式生物反应器放大培养龙眼悬浮细胞,探讨蓝光对龙眼细胞生长及类黄酮积累的影响。基于已建立并优化的龙眼细胞悬浮培养体系,首先研究龙眼细胞在黑暗和蓝光的培养过程中,细胞生长量、类黄酮含量、细胞活力、培养液的底物消耗量等的变化情况。结果发现:龙眼细胞培养9 d后,蓝光的细胞干重比黑暗增长了0.28 g/L,类黄酮含量增长了0.77 mg/g。细胞培养前期蓝光的培养液蔗糖消耗速度慢于黑暗培养,此后蔗糖含量均稳定在2 g/L。培养过程中,蓝光培养的还原糖含量均高于黑暗培养,蓝光的磷酸盐的消耗量基本大于黑暗培养。其次,通过qPCR技术分析光信号转录因子DlHY5、调控基因DlPAP1及类黄酮途径合成基因DlCHS的表达差异。结果表明蓝光可能通过光信号转录因子DlHY5调控基因DlPAP1的表达,进而调控龙眼类黄酮代谢途径合成基因DlCHS的表达,从而导致类黄酮的积累。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

西番莲TeMV和CMV双重RT-PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立西番莲夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的双重RT-PCR检测体系。【方法】根据TeMV和CMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因序列,分别设计两对特异性引物,并对引物组合浓度、退火温度和循环次数进行优化。【结果】优化结果显示:TeMV和CMV最佳引物组合浓度分别为2.0 mmol·L~(-1)和8.0 mmol·L~(-1);最佳退火温度为57℃;最佳循环次数为35次。【结论】灵敏度分析结果显示,在样品c DNA原液稀释到10-5时,仍能检测到两种病毒扩增出的目的条带。同时,以健康组培苗作为对照组,应用建立的双重RT-PCR检测技术对采集于福建省不同产地的36份西番莲样品进行了病毒检测,发现有8份样品同时感染两种病毒,8份样品仅感染TeMV,10份样品仅感染CMV。本研究可为西番莲TeMV和CMV的检测提供便利。     

植物miR172家族成员进化与分子特性分析

为了解植物miR172家族成员的进化与分子特性,对mi Rbase数据库中37个物种的161个miR172前体序列和196个miR172成熟体序列进行进化规律分析,并对植物miR172家族的保守基序、二级结构和靶基因进行预测分析。结果表明:miR172家族成员分布的37个物种都是被子植物,被子植物很可能是miR172家族进化来源的祖先。进化分析表明,植物miR172家族成员序列相似性是其聚类的首要影响因素,其次才是物种差异的影响。植物miR172家族成员成熟体序列分析表明,5p臂上形成的成熟体序列特异性较大,3p臂上形成的成熟体序列保守性较高。二级结构分析发现,植物miR172家族成员具有典型的茎环二级结构,且茎序列的保守性较环序列高。植物miR172前体序列包含1个UNCG环。靶基因预测分析发现,同一物种不同miR172成员的靶基因可能不同;不同物种miR172的靶基因也可能不同,AP2或AP2-like出现频率最高,其次还有arginine decarboxylase 1、Pathogenesis-related、MYB84等靶基因,表明其靶基因功能的多样性。     

龙眼DCL4的亚细胞定位分析及其对外源ABA和SA的响应

为了研究DlDCL家族中DlDCL4基因在龙眼中的功能,本研究通过氨基酸序列比对、系统发育进化树的构建、亚细胞定位验证、实时荧光定量PCR（qPCR）等方法,对其进行初步探究。结果表明：遗传进化分析显示,DCL4氨基酸序列在所选的物种间相似度高于50%,其中龙眼与甜橙（Citrus sinensis）的亲缘关系最近。在激光共聚焦显微镜观察下,洋葱细胞核发出绿色荧光,其他部位不发出荧光,表明龙眼DCL4蛋白定位于细胞核中。在24 h内,100 μmol/L的外源脱落酸（ABA）对 DlDCL4都有极显著的下调效果;100 μmol/L的水杨酸（SA）对其表达量有显著的上调效果,其中8 h时表达量最大,提示 DlDCL4对不同激素的响应效果不同且不同处理时长下响应效果也会有影响。     

橄榄多酚氧化酶基因(PPO)克隆及其试管苗离体保存过程中的表达分析

以来源于橄榄成熟胚的橄榄试管苗为材料,进行PPO基因克隆,比较试管苗不同保存阶段PPO基因转录水平和PPO酶活性的变化。结果表明:克隆获得1个PPO基因全长cDNA序列,命名为PPO2,GenBank登录号为JQ319005,cDNA全长序列为1 934 bp,推测出橄榄PPO开放阅读框(ORF)1 818 bp,编码606个氨基酸。橄榄PPO2属于碱性、亲水、非分泌蛋白,可能定位于线粒体基质空间,具有3个典型的保守结构域,丝氨酸磷酸化占主导地位,并且二级结构以不规则卷曲为主。而三级结构预测表明,橄榄试管苗PPO2蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲组成;进化树分析显示橄榄PPO蛋白与胡杨PPO关系最近,而与葡萄和莲的亲缘关系较远;qPCR分析显示,PPO2基因在橄榄试管苗不同保存阶段都有表达,但在橄榄试管苗保存1个月幼叶比较多时PPO2基因的表达量最高;而橄榄试管苗在分别保存1、2、3、4、5个月时PPO活性变化趋势不明显,当保存时间到6、7、8个月时PPO活性急剧增加。因此,PPO基因可能与幼嫩组织的启动分化有关,并在橄榄试管苗生长发育过程中发挥重要作用。     

金花茶松散型愈伤组织诱导与悬浮细胞系建立

采用组织培养及显微观察技术,以金花茶植株茎段、叶片、花药及离体培养的金花茶体细胞胚为试验材料,对松散型愈伤组织的获得及悬浮细胞系的建立进行了研究。结果表明:在黑暗条件下,以金花茶体细胞胚切块为外植体,在MS+KT 0.5 mg/L+NAA 8.0 mg/L+硝酸银5mg/L+蔗糖30 g/L培养基上诱导出愈伤组织后,将其转接到该诱导培养基上连续培养3个月,最后从培养物中挑选状态良好的松散型愈伤组织在分别含有肌醇与硝酸银的2种培养基上交替培养,可以获得金花茶松散型愈伤组织;方差分析表明:蔗糖添加量、肌醇添加量及硝酸银添加量均对金花茶悬浮培养液细胞密度有显著影响且后两者分别与光照条件存在相互作用;将松散型愈伤组织在分别添加100 mg/L肌醇与2.5 mg/L硝酸银的液体增殖培养基上交替培养,可以建立并保持金花茶悬浮细胞系。该研究结果可为金花茶大规模细胞培养提供科学依据。     

文心兰HSP70基因的克隆及表达分析

为研究文心兰热激蛋白70基因（命名为OnHSP70）的分子特性及表达特点,以文心兰‘柠檬绿’（Oncidium hybridum ‘Honey Angel’）为材料,采用RT-PCR技术克隆OnHSP70,利用生物信息学方法分析其分子特性,通过qRT-PCR技术分析其在不同组织及不同非生物胁迫处理下的表达特点。生物信息学分析表明：该基因开放阅读框为1944 bp,编码647个氨基酸,翻译的蛋白为稳定蛋白,属于HSP70超家族,其蛋白二级结构由41.11%的α-螺旋、17.77%的延伸链、7.73%的β-转角和33.38%的无规卷曲组成,具有2个高度保守的功能域。聚类分析表明：该蛋白与铁皮石斛和深圳拟兰的HSP70亲缘关系较近。qRT-PCR分析表明：文心兰HSP70在4种不同组织器官中具有表达差异性,在花中的表达量最高;高温处理后基因的表达量明显上升;40 ℃高温胁迫4 h时表达量达峰值;茉莉酸甲酯及水杨酸处理时表达量呈现下调响应。本研究为后期该基因功能研究及提高文心兰对高温的适应性提供理论基础。     

基于SSR荧光标记构建睡莲核心种质

采用SSR荧光标记技术对240份睡莲资源进行遗传多样性分析;利用Structure软件分析其群体结构,采用主成分分析和聚类分析进行验证;基于最小距离逐步取样法构建核心种质并进行t筛选验证。结果表明,16对SSR荧光引物共检测到205个等位基因,平均Shannon’s信息指数(I)为0.2036,Nei’s基因多样性指数(H)为0.1168,有效等位基因数(N_e)为1.1697,表明睡莲的遗传多样性丰富。Structure软件分析结果显示最优的群体数K值为3,群体间有少量种质混杂;群体结构分析将240个睡莲品种(种)分为3个类群。采用最小距离逐步取样法,按70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%和10%的比例取样,各个核心子集遗传多样性指数总体上变化不明显;最终确立了15%的取样比例,包含36个睡莲品种(种)核心种质,其中Shannon’s信息指数(I)保留率为117%,Nei’基因多样性指数(H)保留率为118%,有效等位基因数(N_e)保留率为102%。t检验结果表明,构建的包含36个睡莲...     

枇杷胚性培养物中2个ACS基因的克隆及生物信息学分析

以枇杷(Eriobotrya japonica)胚性培养物为材料,采用同源克隆法分离2个ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,简称ACS)基因家族成员EjACS-1和EjACS-2,GenBank登录号分别为GQ370519和GQ370520.结果显示:EjACS-1和EjACS-2的开放阅读框(ORF)长度均为1 464 bp,编码487个氨基酸.2个ACS基因之间核苷酸和氨基酸的一致性分别为92％和93％,且枇杷ACS与蔷薇科苹果亚科植物多种ACS高度同源.此外,从枇杷基因组DNA中分离了1个含有3个内含子、长度2 319 bp的基因gACS,GenBank登录号为GU180353.EjACS-1和EjACS-2的克隆,为今后研究枇杷组织培养中乙烯的作用机理奠定基础.