SYNGR2影响猪圆环病毒2型体外增殖的研究

宿主的Synaptogyrin-2(SYNGR2)蛋白影响猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染能力。本研究旨在研究宿主因子SYNGR2对PCV2在细胞水平增殖的影响，并进一步对SYNGR2影响PCV2体外增殖的机制进行探究。本研究利用基因敲除、过表达、定点突变等手段，在PK15细胞上研究SYNGR2基因敲除及其p.Arg63Cys点突变对PCV2增殖的影响。为探究SYNGR2参与PCV2感染的具体机制，作者对SYNGR2基因敲除的细胞及野生型对照细胞进行转录组测序，筛选SYNGR2功能相关的基因及通路，根据差异表达基因进行表达模式聚类分析，并通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)验证差异表达基因的表达情况。结果显示，SYNGR2基因敲除或p.Arg63Cys点突变显著降低PCV2对PK15细胞的感染能力，对敲除细胞过表达不同基因型的SYNGR2,PCV2的增殖能力均恢复。转录组差异表达基因分析结果显示，SYNGR2的功能主要是参与膜成分及囊泡等被膜细胞器的组成。对差异表达基因肌球蛋白VIIA与Rab互作蛋白(...     

白消安处理消融猪内源精原干细胞的效果及外源精原干细胞移植

目的 研究猪睾丸组织注射白消安消融猪内源精原干细胞(Spermatogonial stem cell,SSC)的效果,以及猪SSC同种异体移植后对内源性SSC消融受体生殖能力恢复的影响。方法 采用3 mg/kg剂量的白消安对9头6周龄大白公猪进行睾丸注射,另外3头注射2 mL 二甲基亚砜作为对照。3周后,对试验组公猪以相同剂量进行第2次睾丸注射。第2次注射3周后,采集试验组和对照组公猪睾丸进行相关检测,评估内源性SSC消融情况。第2次白消安注射1个月后,以两步酶消化法处理5~7日龄大白仔猪睾丸分离得到睾丸单细胞悬液,并用明胶差速贴壁法进行纯化,纯化后以免疫荧光和流式细胞术分析SSC的纯度。异体移植SSC 4个月后,用微卫星标记检测受体公猪精液以及睾丸组织中供体来源SSC的存在。结果 以3 mg/kg剂量的白消安处理大白公猪2次后,睾丸组织苏木精−伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,试验组睾丸曲细精管中各级生精细胞消融但其支持细胞结构完好,可以支持外源性SSC的定植及发育。免疫荧光以及流式细胞术结果表明,分离得到的睾丸单细胞悬液经纯化后UCHL-1阳性细胞占比由差速贴壁前的16.3%提高到了50.8%。苏木精−伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,猪SSC移植4个月后,移植组睾丸组织生精细胞恢复,在受体睾丸曲细精管基底膜上可检测到UCHL-1阳性SSC。受体睾丸组织的微卫星标记分析显示了供体SSC的存在,表明移植进入受体睾丸中的供体SSC可以在受体睾丸中定植存活超过4个月;精液微卫星标记未检测到供体来源的精子。结论 以3 mg/kg剂量的白消安注射公猪睾丸能有效消融内源性SSC,可以用来制备SSC移植的受体猪。两步酶消化及明胶差速贴壁法可成功分离纯化猪SSC。猪SSC经同种异体移植后可以在受体睾丸中定植存活超过4个月。     

靶向切割猪Y染色体的CRISPR/Cas9载体构建及功能验证

【目的】通过CRISPR/Cas9系统对Y染色体多位点切割,实现目标染色体的敲除,为畜禽性别控制提供新的手段。【方法】以CRISPR/Cas9技术为基础,寻找Y染色体上能被sgRNA特异性识别的多拷贝重复序列,并通过体外切割、定量分析、核型鉴定验证其对靶点的有效性。【结果】所设计的sgRNA能够在体外实现对靶片段的明显切割,且切割效率均达到了50%以上。基因的定量分析结果证明了其在细胞水平切割的有效性,且簇状重复序列切割效果明显优于散在重复序列;核型鉴定结果证实了细胞水平猪Y染色体的丢失。【结论】研究结果为后续构建染色体敲除猪,实现猪的性别控制奠定了基础。     

CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究

【目的】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。【方法】用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型...     

CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。     

转基因和基因编辑猪的研究进展

猪是重要的农业经济动物,其在遗传背景、解剖学、生理病理学、营养代谢和疾病特征等方面与人类高度相似,是农业生产性状改良、人类疾病动物模型和异种器官移植研究的重要对象。随着ZFN、TALEN和CRISPR等基因编辑技术的出现,转基因或基因编辑猪的研究取得快速发展。本文将结合当前我国转基因及基因编辑猪的研究现状,对基因编辑技术在农业生产性状改良如提高产肉量、改善肉质、提高抗病能力和建立人类疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植等方面进行综述,以期为猪遗传改良和医学研究提供参考。     

ETV5基因敲除对小鼠肌肉基因表达谱的影响

【目的】与野生型小鼠相比较,采用CRISPR/Cas9技术制备的ETV5基因纯合敲除小鼠在表现出内源性精原干细胞消融的同时伴随着体型和体质的明显弱势,本研究的目的是探究ETV5基因敲除对小鼠肌肉表达谱的影响。【方法】采集6周龄的3只野生型公鼠和3只ETV5纯合敲除公鼠的肌肉组织并抽提RNA,进行转录组测序,并对测序结果进行生物信息学分析,对2组小鼠肌肉样品的差异表达基因进行聚类分析、GO和KEGG富集分析。【结果】2组小鼠的肌肉组织共筛选出了574个差异表达基因,其中,上调基因292个,下调基因282个。发现了多个基因影响ETV5敲除小鼠的生长发育,其中,包括影响小鼠肌肉发育的基因Amd1和影响脂肪累积的基因Chrna2。GO和KEGG分析富集到的通路大多与脂肪代谢和生长发育相关。【结论】本研究结果为ETV5敲除小鼠生长发育缓慢和延迟的分子机制提供了解释,为研究ETV5在生理和病理上的相关功能提供了参考。     

精原干细胞体外培养体系的建立

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性哺乳动物精子发生及具有生育能力的保障。精原干细胞的体外培养不仅为精子发生的研究提供材料,还有助于开发新的家畜保种方法和动物遗传修饰。为了探索猪精原干细胞体外培养体系的建立方法,本研究采用胶原酶Ⅳ-胰酶两步酶法对3~7日龄大白仔猪睾丸进行消化得到单细胞悬液,利用不同时间程序的差速贴壁对精原干细胞进行纯化,选择大白仔猪睾丸支持细胞作为饲养层,添加不同细胞因子研究精原干细胞的增殖情况以期得到最佳的培养体系。结果显示,通过差速贴壁得到的UCHL-1阳性生殖细胞比例最高为18.59%±0.94%;不同细胞因子组合添加试验发现精原干细胞添加20 ng·mL^-1 GDNF、10 ng·mL^-1 IGF和20 ng·mL^-1 bFGF的增殖效果最佳;以支持细胞作为饲养层、在DMEM/F12中添加1%FBS以及上述细胞因子组合对精原干细胞进行培养15 d后可见大量的精原干细胞集落,通过免疫荧光、AKP染色、荧光定量PCR等试验证明精原干细胞进行了大量增殖。本研究初步建立了猪精原干细胞的体外培养体系,可通过体外培养大量增殖精原干细胞,为后续精原干细胞的研究奠定基础。     

基因编辑技术在猪遗传育种中的研究进展

基因编辑是针对基因组特定的靶点序列,利用人工特异性核酸酶对靶点序列进行编辑(基因敲除、插入、替换等修饰)的技术。基因编辑技术广泛应用于生物医学研究以及农业遗传育种改良。猪作为重要的农业经济动物,是养殖最为广泛的肉用型家畜,随着人类物质需求的提高,现代养殖业需要培育更多具有优良经济性状、适应人们多样化需求的新品种。利用基因编辑技术提高猪的生产性能、抗逆性能和抗病性能是未来生猪种业发展的重要方向。本文综述了基因编辑猪在畜牧业遗传育种领域的研究进展,并展望了该领域当前面临的挑战和未来发展方向。