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1.
试验旨在筛选并制备鸡PD-1单克隆抗体,对该单克隆抗体的免疫学特性、结合活性及其对鸡PD-1/PD-L1信号通路激活的阻断作用进行初步研究。运用杂交瘤细胞融合技术筛选杂交瘤细胞株,采用ELISA方法、Ig抗体亚型鉴定试剂盒、Western blotting鉴定抗体的免疫学特性,利用间接免疫荧光技术及流式细胞术检测筛选单抗与鸡PBMCs的结合情况,应用该单抗与IBDV感染7 d后的鸡PBMC细胞作用,利用实时荧光定量PCR技术检测IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的表达情况。结果显示,试验获得1株特异、稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为PD-1-D05。该单克隆抗体的亚型属于IgG1,杂交瘤细胞培养上清和腹水的效价分别为1:211和1:2.048×105。ELISA和Western blotting检测结果表明,PD-1-D05单抗能与免疫原发生特异性反应,与pET-28a (+)、Rosetta菌株蛋白提取液上清及无关蛋白无交叉反应。间接免疫荧光及流式细胞术检测结果显示,PD-1-D05单克隆抗体能与鸡PBMC特异性结合,且IBDV感染7 d后的PBMC经单抗处理后,IL-2表达量显著升高(P<0.05),IFN-γ转录水平显著下降(P<0.05),IL-6表达水平较IBDV攻毒组细胞虽有所下降,但并无统计学差异(P>0.05)。结果表明,试验成功筛选并制备了能够稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的细胞株,所获得的PD-1单克隆抗体具有良好的免疫学特性,该单抗能够特异性识别鸡PD-1分子并与鸡PBMC细胞特异结合,并在一定程度上恢复由于IBDV感染导致的PD-1/PD-L1信号通路激活引发的免疫调节相关细胞因子IL-2、IFN-γ的异常表达。  相似文献   
2.
3.
为研究鸡程序性细胞死亡因子1(PD 1)胞外区的生物学活性,根据 GenBank 中的鸡 PD 1基因序列,经生物信息学比对分析,设计鸡 PD 1胞外区特异性克隆引物,扩增目的基因,连接原核表达载体 pET 28a(+),构建重组表达载体 pET 28a PD 1,转化至 Rosetta(DE3)大肠杆菌,并对IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,对表达产物进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析,应用流式细胞术对所获得重组蛋白的生物学活性进行鉴定。结果显示,成功克隆了鸡 PD 1胞外区基因;SDS PAGE 和 Western blot 分析结果表明,37℃、0.1 mmol/L IPTG 诱导4 h 时,PD 1胞外区融合蛋白表达量最高,以包涵体形式存在;流式细胞术分析结果表明,PD 1胞外区重组蛋白具有一定的生物学活性。  相似文献   
4.
选用40%氯虫苯甲酰胺·噻虫嗪水分散粒剂10 g/667 m2,63.1%杀单·苏云可湿性粉剂50 g/667 m2和15%阿维·三唑磷乳油100 m L/667 m2处理二化螟,进行药效对比试验。试验结果表明:40%氯虫苯甲酰胺·噻虫嗪水分散粒剂10 g/667 m2,63.1%杀单·苏云可湿性粉剂50 g/667 m2对二化螟有较好的防效,两者药后14 d防效分别为92.61%和90.46%,且对水稻生长安全,对其他有益生物未见药害。  相似文献   
5.
建立鸡PD-1及配体PD-L1/PD-L2SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,并用所建立的方法研究和分析雏鸡感染IBDV的不同阶段体内PD-1及配体PD-L1/PD-L2的转录变化。根据GenBank中PD-1、PD-L1和PD-L2的基因序列,分别设计特异引物扩增目的基因,得到各自阳性克隆质粒,以阳性质粒作为标准品建立标准曲线,并进行敏感性、特异性和重复性试验。应用所建立的实时荧光定量RT-PCR方法对4周龄健康雏鸡人工感染IBDV后第3、5、7、10天PBMC中PD-1及配体PD-L1/PD-L2的转录变化进行检测,同时用半定量RT-PCR方法以及IBDV快速检测试纸条对病毒感染后各时间点法氏囊组织中IBDV的载量进行检测。结果表明,建立的方法在1×101~1×109 copies·μL-1模板范围内具有良好的线性关系(R2>0.99),可检测至少101copies·μL-1的阳性标准样品,且具有较好的特异性和重复性。IBDV感染后,病毒在雏鸡体内复制逐渐增加,至第5天病毒载量达到最高。实时荧光定量RT-PCR检测结果表明,PD-1及配体PD-L1/PD-L2在病毒感染后不同阶段转录量均有所升高,其中PD-1在病毒感染后第7天显著(P<0.05)升高,在病毒感染后第3天PD-L1极显著(P<0.01)升高,PD-L2显著(P<0.05)升高。本研究成功建立了PD-1及配体PD-L1/PD-L2实时荧光定量RTPCR检测方法;并应用该方法初步分析了PD-1及配体PD-L1/PD-L2在IBDV感染不同阶段的转录变化,发现IBDV感染后不同阶段PD-1及配体PD-L1/PD-L2的转录均升高,且PD-L1、PD-L2的转录先于PD-1升高,并与病毒载量呈正相关。  相似文献   
6.
为研究胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)中雌激素(estradiol,E2)对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达的调节作用,本研究首先培养小鼠胸腺髓质上皮细胞系1(medullary thymic epithelial cell line 1,MTEC1),经50 nmol/L E2作用24 h后,观察对细胞表型变化的影响,并用CCK-8试剂盒检测细胞活力;提取细胞总RNA,运用实时荧光定量PCR技术验证E2对lncRNA-2410006H16Rik表达的调节作用;最后运用RT-PCR技术扩增其目的基因,构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik重组过表达载体。结果显示,50 nmol/L E2能够明显抑制MTEC1的增殖,且相较于对照组细胞,50 nmol/L E2处理组细胞的D450 nm值极显著降低(P<0.01),表明其细胞活力极显著下降。实时荧光定量PCR结果显示,在E2作用下,lncRNA-2410006H16Rik在MTEC1细胞中的表达极显著上调(P<0.01),约是对照组的2倍,与高通量测序结果一致。经RT-PCR、双酶切及测序结果分析显示,试验成功构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik表达载体。结果表明,TECs中lncRNA-2410006H16Rik的表达与E2作用密切相关,为后续在细胞水平上进一步验证lncRNA-2410006H16Rik的调节功能奠定了基础。  相似文献   
7.
为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5 000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD_(450)0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%~7.69%和2.16%~9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。  相似文献   
8.
为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。  相似文献   
9.
配方肥是根据土壤测试数据为用户专门生产的混配肥料,配方肥的应用是测土配方施肥工作的最终目标,而测土配方施肥的主要两个环节——技术环节和应用环节往往发生脱节,造成配方肥应用情况不理想。为找出症结所在,使技术环节和应用环节紧密相连,较好地走完测土配方施肥工作"最后一公里",通过对配方肥应用情况的调查,提出影响四平市配方肥应用的因素及对策。  相似文献   
10.
2.4-D丁酯是一种选择性除草剂,具有良好的展着性和内吸性,不易被水冲刷,药效持久,对人、畜毒性较低。该除草剂主要防除禾本科作物田中的双子叶杂草、莎草及恶性杂草,在玉米生产上使用较多。近几年因使用2.4-D丁酯除草剂,已在玉米和其它作物上引发药害,对农业生产造成一定的经济损失和社会影响。本文根据生产实际,对2.4-D丁酯产生药害的原因进行分析,并提出预防建议及解救对策,谨供农业生产参考。  相似文献   
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