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非洲猪瘟(ASF)于2018年传入我国后已流行了2年有余,我国非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株未曾出现较大变异。最近,针对我国ASF疫情放缓以及感染猪出现的低死亡率现象,我们在ASFV生态学研究中,从主动监测的样品中分离到1株源自湖北某地的ASFV自然变异株。经基因组测序发现,其EP402R基因(CD2v)和上游相邻的EP153R基因(8CR)出现部分缺失,共计1252 bp,导致病毒血吸附特性丧失;在多处基因编码区和基因间隔区出现独有的碱基突变、缺失或插入,与国内已经发表的10个ASFV毒株完全不同,这些变化导致病毒蛋白氨基酸组成的改变和功能丧失;在基因组3′末端出现503 bp串联重复的核酸片段插入,该片段与国外毒株基因组末端部分序列有高达96%的同源性。该变异株不含任何已知标记基因,说明我国的ASFV已经出现了自然变异株,可能和目前呈现的亚急性型流行的ASF有关。 相似文献
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2018年中国首次发生了非洲猪瘟疫情。本研究从来源于沈阳地区的1个非洲猪瘟病毒(African swine fever vi?rus, ASFV)分离株中克隆了p30基因(GenBank No. MK482370)。序列分析发现,该基因与安徽分离株相同(GenBank No.MK128995),而与已报道的沈阳分离株SY-18株(GenBank No. MH766894)不同,新克隆的p30基因全长585 bp,编码194个氨基酸,而SY-18株p30基因全长606 bp,编码201个氨基酸。该结果提示,我国的ASFV存在基因变异或者传播来源复杂,流行病学分析应关注该基因,不同毒株的致病力有待深入研究。本研究利用pGEX-6p-1表达系统成功表达了p30基因的亲水区;通过Ni-NTA-琼脂糖亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,获得了纯度较高的重组蛋白,为ASFV的血清学监测提供了抗原。 相似文献
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利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25 µL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃ 10 s,39℃ 20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10 拷贝/µL,对已知阳性临床组织样品可检至1﹕103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。 相似文献
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