猪圆环病毒2型广东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计2对特异性引物,对广东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMW S)组织病料进行了PCV2全基因组克隆和序列分析.结果表明,PCV2核苷酸序列较稳定,不同地区6个PCV2毒株全基因组序列均由1 767 bp组成,彼此间核苷酸序列相似性达95.3%~99.8%,亲缘关系密切;与GenBank已发表的国内不同地区PCV2参考毒株的相似性介于70.1%~99.1%;与欧洲各地区毒株的相似性介于67.7%~98.8%;其中与美国的毒株(AY094619)差异性最大,介于69.4%~70.8%之间.     

PRRSV变异株ORF6基因重组杆状病毒的构建及其在昆虫细胞的表达

参照GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株ORF6(M蛋白)基因序列,设计合成了一对引物,扩增PRRSV ORF6基因.将该基因克隆于转移质粒载体pFcDNA3.1(+)中,获得重组转移质粒pFcDNA3.1-ORF6并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-ORF6,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-ORF6,经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组的CMV启动子下游;经过问接免疫荧光试验(IFA)检测,M蛋白在SD细胞中得到了表达,而且表达的产物具有特异免疫学反应性.     

猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5重组杆状病毒疫苗的研究

参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT—PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank收录的PRRSV基因序列，利用PRRSV经典变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点，设计合成两对特异性引物，经RT-PCR扩增后，用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化到大肠杆菌DH-5a株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定，证实为PRRSV缺失变异株与经典变异株的阳性重组质粒。将重组标准质粒进行10倍系列稀释后作为模板，通过实时荧光定量PCR法（Realtime PCR），建立了PRRSV缺失变异株与经典变异株的标准曲线及其直线回归方程，并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点，为鉴别诊断及分析PRRSV缺失变异株与经典变异株感染猪体内病毒的绝对含量提供了技术手段。