FRBI对CA125、EGF、E2和IP3分泌及ERβmRNA和蛋白表达的影响

为了探究促卵泡激素受体结合抑制剂(FRBI)是否影响卵母细胞中糖类抗原125(CA125)、表皮生长因子(EGF)、雌二醇(E_2)、三磷酸肌醇(IP3)和cAMP分泌,雌激素受体β(ERβ)mRNA和蛋白表达水平,并阐明FRBI作用的信号通路。以绵羊卵丘-卵母细胞复合体(COCs)作为研究对象,在培养基中分别添加10,20,30,40μg/mL的FRBI,分别检测培养液中CA125、EGF、E_2、IP3和cAMP的浓度,研究卵母细胞中ERβmRNA和蛋白表达水平。结果显示与对照组(CG)相比较,FRBI-3组和FRBI-4组CA125和IP3浓度降低。FRBI-1组CA125和FRBI-2组IP3浓度明显高于CG。E_2浓度随FRBI添加量增加(从10μg/mL到30μg/mL)而升高,FRBI-3组E_2浓度最高。FRBI-3组和FRBI-4组cAMP浓度明显低于CG和FSH组。FRBI组ERβmRNA和蛋白表达水平逐渐降低,FRBI-4组ERβ蛋白水平低于FSH(P0.05)。FRBI浓度与EGF和E_2呈正相关。结果表明,高剂量的FRBI能抑制绵羊卵母细胞中CA125、cAMP和IP3产生,增加E_2浓度,降低卵母细胞ERβ基因和蛋白表达水平,FRBI可能抑制IP3和cAMP信号通路。     

猪轮状病毒的细胞培养特性研究

目的:探讨动物轮状病毒细胞培养的特性和适宜条件,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:制备三种细胞培养液(A、B、C组),经对MA-104细胞培养,确定最适培养液,高倍光镜下观察细胞形态的变化。结果:MA-104细胞用含10%小牛血清加高糖DMEM的培养液(C组)培养时贴壁较快,生长良好,成本较低。传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),细胞膜缩融合、细胞层裂开、出现细胞核固缩,空泡化、染毒的细胞出现大片脱落区域,最后细胞死亡脱落,随传代次数增加,病变程度加深,CPE出现时间加快。没有脱落的细胞出现拉网现象。当CPE达到90%的时候开始收毒。结论:PRV在MA-104细胞中能良好生长,培养的最佳条件为37℃5%CO2,2-3d,传代18h后出现CEP,随传代次数增加,病变程度加深。     

GnRH-A免疫对兔去势效果的实验研究

探讨促性腺激素释放激素类似物(GnRH-A)对动物免疫去势的效果和作用机理.用自制的GnRH-A抗原乳剂在30只兔(EG-Ⅰ与EG-Ⅱ组)的颈背部皮下分2～3点注射1.0 mL(100 μg·mL-1)GnRH-A抗原,EG-Ⅱ组3周后加强免疫1次.测定睾丸长度和质量,体质量变化,GnRH抗体效价与血清睾酮浓度.制备的抗原无菌性、安全性和物理性状良好,EG-Ⅱ组睾丸长度与EG-Ⅰ组差异极显著(P<0.01);EG-Ⅱ组的抗体水平也明显高于EG-Ⅰ组;免疫注射后2个试验组与对照组的血清睾酮浓度差异逐渐增加,102 d时EG-Ⅱ组血清睾酮浓度极显著低于对照组(P<0.01),且第28天后EG-Ⅱ组显著低于EG-Ⅰ组(P<0.05);EG-Ⅱ组雄兔的体质量和平均日增质量均最大,显著高于EG-Ⅰ组和对照组(P<0.05).GnRH-A免疫家兔对睾丸发育、血清GnRH抗体效价和睾酮浓度具有显著的影响,加强免疫效果更理想.     

阿拉瑞林免疫对FSHR表达与子宫发育的影响 

为研究GnRHa主动免疫对绵羊子宫FSHR表达与分布及子宫发育的作用,探讨GnRHa调节生殖功能的机制,将42只5～6月龄母绵羊(Ovis aries)随机分为6组(n=7)。EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ动物分别皮下注射阿拉瑞林(alarelin)抗原200、300和400μg,0 d和14 d各1次;EG-Ⅳ和EG-Ⅴ动物皮下注射alarelin抗原200μg和300μg,0、7、14和21 d各1次;对照组皮下注射药物溶媒,0 d和14 d各1次。于70 d在颈动脉放血处死绵羊,无菌切取两侧子宫角。免疫组织化学SP法染色并进行图像分析,光学显微镜和电子显微镜分别观察子宫显微和超微结构变化。Western blot分析FSHR蛋白表达。结果发现各试验组FSHR蛋白表达量随着alarelin免疫剂量和次数的增多而逐渐增加。EG-Ⅲ和EG-Ⅴ极显著高于对照组(P<0.01)。FSHR主要分布于子宫内膜细胞和子宫腺上皮细胞的胞质和胞核;EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ灰度值逐渐升高,EG-Ⅲ和EG-V(P<0.01)显著高于CG,证明alarelin主动免疫能增强子宫FSHR的分布与表达,加大注射剂量和次数作用更明显。EG-I、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ的子宫质量、UWT和EET均变小,EG-Ⅲ和EG-Ⅴ显著小于对照组(P<0.05)。试验组出现不同程度的子宫壁和上皮变薄,细胞胞质减少,腺体数量减少,腺腔缩小,平滑肌细胞及核均变小。线粒体和线粒体嵴减少,微绒毛变短,以EG-Ⅲ最明显。结果表明,Alarelin主动免疫母羊能增强子宫FSHR的分布与蛋白表达,使子宫超微和超微结构明显改变,抑制子宫发育,尤其是子宫内膜的生长显著受阻。     

阿拉瑞林主动免疫对绵羊垂体GnRHR、FSHR和LHR表达及卵巢GnRHR分布的影响

为探讨促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂主动免疫对绵羊腺垂体GnRH受体(GnRHR)、促卵泡激素受体(FSHR)和促黄体激素受体(LHR)表达及分布的影响,将42只5～6月龄母绵羊分为6组(n=7),即EG-Ⅰ组、EG-Ⅱ组、EG-Ⅲ组、EG-Ⅳ组、EG-Ⅴ组和对照组(CG)。EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ组绵羊分别皮下注射200μg、300μg和400μg阿拉瑞林抗原,分2次皮下注射(0 d和14 d),EG-Ⅳ和EG-Ⅴ组绵羊分别皮下注射200μg和300μg阿拉瑞林抗原,分4次皮下注射(0 d、7 d、14 d和21 d),对照组(CG)绵羊皮下注射2.0 ml溶剂,分2次(0 d和14 d)。于70 d无菌切取腺垂体、子宫及卵巢,提取垂体总RNA,PCR扩增,反转录,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测,免疫组织化学SP法染色。结果表明,GnRHR、FSHR和LHR mRNA PCR扩增曲线的起始循环数分别为20、28和24。5个试验组Gn-RHR、FSHR和LHR mRNA值均低于对照,EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ组的mRNA值逐渐下降;EG-Ⅳ和EG-Ⅴ组的mRNA值分别低于EG-Ⅰ和EG-Ⅱ组。GnRHR阳性染色主要分布在卵泡细胞以及卵母细胞胞质和胞核及胞膜。各组的染色强度不同,以EG-Ⅲ阳性染色最为明显。阴性对照全部为阴性。显微图像的绿色值和亮度无显著差异,各组灰度值差异显著(P<0.05),以EG-Ⅱ均为最小,EG-Ⅴ最高。EG-Ⅰ的饱和度最小(P<0.05),EG-Ⅲ最高。上述结果说明阿拉瑞林抗原免疫抑制垂体GnRHR、FSHR和LHR mRNA表达,GnRHR阳性染色主要在卵母细胞和卵泡细胞的胞核和胞质。阿拉瑞林免疫可抑制卵巢GnRHR的分布与表达,增加注射剂量和次数作用更明显。     

猪轮状病毒的细胞培养特性与FQ-PCR检测方法的建立

为了探讨动物轮状病毒的细胞培养特性和分离方法,建立FQ-PCR检测方法,旨在为研发诊断试剂盒和疫苗莫定基础.37℃5%CO2下用细胞培养液C培养ELISA检测的阳性猪粪便样本,观察细胞形态的变化;用RV感染MA-104细胞,分离纯化病毒,测定VP6基因序列并分析其同源性,在普通PCR和实时定量PCR的基础上,建立FQ-PCR检测方法.结果,MA-104细胞培养的最佳条件为37℃5%CO2 ;接毒后18 h出现细胞膜缩融合、细胞层裂开、细胞核固缩及空泡化等明显的细胞病变(CPE),CPE达到90%时可收毒;分离到1株猪轮状病毒(暂命名为GSPRV01株),得到VP6为1 200 bp,与标准株(AV-55)的同源性为88.50%.     

牛轮状病毒VP7基因荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒(BRV) VP7基因的荧光定量PCR检测方法,本研究设计扩增BRV VP7基因的特异性引物,将扩增的VP7基因片段(342 bp)克隆于pMD 18-T载体中(pMD-VP7),作为重组质粒标准品,建立EvaGreen荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法.经反应条件优化,结果表明该方法的最低检测量为8.03拷贝/μL.该方法对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性.批内和批间重复变异系数均小于3％.采用该方法对12份ELISA阳性样本检测出10份阳性,符合率83.33％.本研究建立的BVR VP7 qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和对标本的检测能力较强等特点,可以用于临床诊断和流行病学调查.