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本研究克隆了水牛骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein-1,BMP1)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还运用实时荧光定量PCR技术对BMP1基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆得到水牛BMP1基因的cDNA序列长度为3 195 bp,其中包含完整的2 967 bp的开放读码框(ORF),编码988个氨基酸。经序列相似性分析显示,水牛BMP1基因与牛、猪、马、人和小鼠相应氨基酸序列相似性分别为99%、96%、96%、96%和95%,具有很强的保守性。结合系统进化树分析结果推测,BMP1基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛BMP1蛋白的结构域预测结果发现,其存在1个信号肽区、1个前肽区、1个金属蛋白酶区、5个CUB区和2个EGF-like功能区。定量表达分析结果显示,BMP1基因在水牛心脏组织中相对表达量最高,睾丸、卵巢和生殖嵴等性腺器官表达量次之,骨头等其他组织表达量较低,肝脏表达量最低。 相似文献
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本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。 相似文献
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研究了水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFF)转染外源基因后的细胞生物学特性。纯化含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和新霉素抗性基因的线性化载体,用脂质体法转染体外培养3代的BFF细胞,应用抗生素G418筛选2周后挑取转基因抗性细胞集落扩大培养。结果发现:经过G418筛选后细胞增殖活力下降,胰蛋白酶消化法共分离获得162个转基因水牛阳性细胞集落,转移到24孔板扩大培养后,132个(85.2%)细胞集落可以存活,转移到4孔板中后仅有52个(32.1%)细胞集落能继续生长,最终能在35mm培养皿中大量培养的只有15个(〈9.3%)。抗性细胞由梭形、成簇生长变为多角形、不规则形弥漫生长,立体感减弱,细胞生长速度减慢,活力下降。染色体核型异常率增加,10个抗性细胞集落核型正常率平均为61%,显著低于对照组86.7%(P〈0.01)。研究结果为建立和优化BFF细胞转染外源基因平台奠定了工作基础。 相似文献
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本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞(iPSCs)中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞(BFF),利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。 相似文献
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本试验通过实时荧光定量PCR方法对多能基因Oct4和Nanog及DNA甲基化相关基因Dnmt1和Tets在徒手克隆(handmade cloning,HMC)胚胎中的表达模式进行初步研究,并探讨5-Aza-CdR处理重构胚对这些基因表达模式的影响。结果显示,Oct4、Nanog和Tet3的表达在2细胞时期达到顶峰,Dnmt1和Tet2基因的表达随HMC胚胎发育而下降,而Tet1基因随HMC胚胎发育表达上升。使用5-Aza-CdR处理重构胚没有改变Oct4、Tet1和Tet3基因的表达模式,使Nanog基因在胚胎发育初期表达增加,Dnmt1和Tet2基因在胚胎发育初期表达降低。研究初步确立了Oct4、Nanog、Dnmt1和Tets基因在HMC胚胎的表达模式,5-Aza-CdR对重构胚的处理可对HMC胚胎的甲基化模式产生影响。 相似文献
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[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20~22h后随机分为2组,①在体外受精7~10或18~20h后向卵胞质内注入约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②则分别注入单个精子与约7.5pL50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P>0.05),且IVF7~10h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18~20h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7~10h注射的效果优于IVF后18~20h注射。 相似文献
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本实验比较了已报道的4组常用的猪卵母细胞电激活方法,并对电激活参数进行系统探索。结果表明:电激活参数(125 V/mm,80μs,1 DC),激活液0.3 mol/L甘露醇+0.1 mmol/L MgSO4+0.1 mmmol/L CaCl2+0.01%PVA的激活方案,囊胚发育率显著优于其他3组方案(25.6%vs 12.6%vs 21.5%vs 15.2,P<0.05);脉冲电压100 V/mm时3次脉冲激活组囊胚发育率优于2次和1次脉冲组(27.3%vs 16.2%vs 21.7%,P<0.05);激活液中Ca2+浓度(0.1%,0.05%)对激活效果无显著影响,囊胚发育率分别为36.5%和40.9%;本实验结果中电激活效果明显优于化学激活(46.3%vs 29.4%,P<0.05)。通过上述实验本研究建立了一种优化的猪卵母细胞电激活方法,为生产单精子显微注射与体细胞核移植猪奠定了基础。 相似文献
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[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82%和87.45%;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P<0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P>0.05).[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性. 相似文献
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[目的]克隆广西德保猪抵抗素(Resistin,RENT)基因并进行系统生物信息学分析,阐明德保猪脂肪细胞分化与脂肪生成的分子机制.[方法]根据NCBI已公布的猪RENT基因序列(NM 213783.2)设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的总RNA为模板,PCR扩增RENT基因序列,T-A克隆至pEASY-T1载体后进行测序分析,并将所得测序结果用BLAST程序、MEGA 5.0软件、EXPASY服务器、SMART程序、SignIP程序、Softberry服务器和DNASTAR软件进行生物信息学分析.[结果]扩增获得468 bp的RENT基因序列片段,包含全长的德保猪RENT基因编码区和部分非编码区序列.多重序列比较分析结果显示,德保猪RENT基因编码区核酸序列与猪、牛、山羊、绵羊、人、兔、猕猴和豚鼠的同源性分别为100.0%、85.5%、85.5%、84.5%、81.2%、80.3%、80.0%和77.3%.德保猪RENT蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量11.69 ku,等电点7.82,为弱碱性蛋白;N-末端存在信号肽,定位于胞质外,仅具有1个低复杂度结构域,包含1个α-螺旋、8个β-折叠、7个T-转角及两个无规则卷曲.[结论]RENT基因在德保猪中呈高度保守特征,是其脂肪细胞分化中的重要调控基因. 相似文献