ILTV Glycoprotein B(gB)与鸡Interleukin-18(IL-18)真核双表达载体的构建及表达

将ILTV gB基因和鸡IL-18基因插入到真核双表达载体pIRES中,构建共表达gB和IL-18基因的重组质粒pIRES-gB/IL18和表达gB基因的pIRES-gB质粒.通过脂质体将其转染鸡胚成纤维细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组质粒在体外的表达.将重组质粒通过腿部肌肉多点注射免疫21日龄雏鸡,应用E...     

猪伪狂犬病病毒河南分离株gE全基因的克隆与序列分析

为了确定河南部分地区按照正常免疫程序接种猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失苗的猪场是否发生了PRV野毒感染,了解新流行株的主要毒力基因g E是否发生变异,利用PCR方法,对南阳、周口、巩义、济源、漯河、原阳等地采集的疑似PRV感染的病料进行检测。对PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞,传至6代,分离出9株PRV,克隆其g E全基因并进行序列分析。结果表明,9株PRV均能扩增出1 862 bp的g E基因,且彼此之间同源性为99.9%~100%,与其他PRV毒株同源性为97.5%~99.6%。9株分离株处于一大分支上,且均含有2个氨基酸插入,在448位和510位均发生氨基酸置换。结果表明,分离株均为PRV野毒株,且g E基因有不同程度的变化,与河南省伪狂犬病的重新流行有密切联系。     

长白猪肿瘤坏死因子α成熟肽基因克隆、表达及其表达产物活性检测

本研究旨在克隆和表达猪肿瘤坏死因子成熟肽基因及其表达蛋白的生物活性。根据GenBank登录的猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)成熟肽基因序列设计一对上下游引物。应用RT-PCR技术直接从丹系长白猪脾脏组织中扩增猪的TNF-α成熟肽基因。将RT-PCR扩增到的特异性片段克隆到pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-TNF重组质粒,经宝生物(大连)有限公司测序,该TNF-α成熟肽基因的长度为465 bp,编码154 aa。以重组克隆质粒pGEM-TNF为模板,PCR扩增猪TNF-α成熟肽基因,并将其插入原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明表达的融合蛋白约为38 ku,重组蛋白以包涵体形式表达,表达重组蛋白约占菌体总蛋白的36.8%。细胞毒T细胞试验表明所表达的蛋白经初步纯化、变性复性后,可明显增强淋巴毒性T细胞作用。结果提示长白猪肿瘤坏死因子得到了成功克隆与表达,表达的蛋白产物具有一定的生物活性。     

金银花、山银花黄酮类提取物体外抗伪狂犬病病毒作用研究

分别提取湖南金银花和山银花黄酮类活性成分,利用Vero细胞体外培养系统,通过观察细胞病变效应（CPE）来评价中药金银花和山银花黄酮类提取物体外抑制伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）对细胞的感染作用,并通过MTT法检测细胞活性。研究比较金银花、山银花的抗病毒作用,初步探讨中药抗病毒机制。结果表明：在安全浓度范围内,金银花和山银花黄酮类提取物均具有显著的抗病毒作用,体外对PRV分别具有明显的阻断、抑制和中和作用,其中山银花对PRV体外的抑制作用强于金银花,而阻断作用和中和作用,两者差异不显著。     

猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立

粪肠球菌和屎肠球菌是引起猪感染发病的优势肠球菌种,以肠球菌的16 S rRNA基因设计属特异性引物,利用SodA基因多态性设计种特异性引物,同时优化反应条件,建立了能同时测定猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR方法。通过对来源于猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株进行测定,均能成功扩增出属特异性片段和种特异性片段。经过与快速生化鉴定试剂盒(Vitek-32)和16 S rRNA测序方法比较,多重PCR与16 S rRNA测序方法对猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株的鉴定符合率100%;与Vitek-32鉴定符合率为62.3%,其中,与分离于感染猪的临床菌株符合率仅有46.7%,特别是感染猪的屎肠球菌,符合率仅为22.3%。     

猪IL-2成熟蛋白在昆虫细胞中的表达及生物学活性鉴定

以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增猪IL-2成熟蛋白基因。将猪IL-2成熟蛋白基因定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2,转染昆虫细胞。间接免疫荧光试验表明重组猪IL-2在Sf9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为20000的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,重组猪IL-2经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,重组猪IL-2在昆虫细胞中得到表达,表达的重组蛋白具有一定生物学活性,为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。     

一株致仔猪关节炎粪肠球菌的鉴定

对1株分离自关节炎病仔猪的肠球菌进行鉴定。选用常规方法进行染色特性、培养特性观察以及药物敏感性和致病试验,然后利用Vitek-32全自动细菌鉴定系统进行生化特性鉴定,并用PCR方法扩增分离株的16 S rRNA基因,克隆并测序,与GenBank上登录的相关菌株及3个粪肠球菌标准菌株进行16 SrRNA序列比较、同源性分析并构建系统发育树。结果显示,该分离株形态及染色特性与肠球菌一致,对仔猪具有一定的致病性,并对临床常用的7种药物产生了耐受性;Vitek-32生化鉴定和16 S rRNA基因同源性分析及比对结果均显示其为粪肠球菌(E.faecalis)。试验证实了粪肠球菌可导致仔猪关节炎。     

RAPD技术在产气荚膜杆菌基因分型中的应用研究

采用随机扩增多态性ＤＮＡ技术对产气荚膜杆菌进行ＰＣＲ扩增。结果产气荚膜杆菌Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４个型均可扩增出约４３０ｂｐ的条带，Ｂ，Ｃ型还扩增出约２１０ｂｐ条带，Ｂ，Ｄ型还扩增出约１２１０ｂｐ条带，Ａ型还扩增出约２４０ｂｐ和６９０ｂｐ条带，各型之间的条带差别明显，从而为产气荚膜杆菌的基因分型、ＰＣＲ快速诊断提供可靠的依据。     

金银花、山银花绿原酸类提取物体外抗NDV作用研究

为研究比较价格差异较大的金银花和山银花的体外抗病毒作用，分别提取金银花和山银花绿原酸类活性成分，利用Vero细胞体外培养系统，通过观察细胞病变效应（CPE），并用MTT法检测细胞活性来评价和比较金银花和山银花绿原酸类提取物体外抑制新城疫病毒（NDV）对细胞的感染作用。结果表明：在安全浓度范围内，金银花和山银花绿原酸类提取物均具有显著的抗病毒作用，体外对NDV分别具有明显的阻断作用、抑制作用和中和作用，且两者之间的抗病毒效果差异不显著。本试验为价格相对便宜的山银花在一定领域部分代替金银花提供了实验依据。     

猪伪狂犬病病毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),设计并合成1对引物.通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验.结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.999 9,最低检测的拷贝教为35.4拷贝/25 μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点.本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.