饲喂青贮桑叶对陕北白绒山羊PPARγ、ADIPOQ、aP2 mRNA表达的影响

试验旨在研究日粮中添加不同水平的青贮桑叶对陕北白绒山羊脂肪组织(皮下脂肪、尾部脂肪、肾周脂肪)、肝脏、肌肉组织中PPARγ、ADIPOQ、aP2mRNA表达的影响。选取8~9月龄体重相近体况基本一致的陕北白绒山羊羯羊40只,随机分为4组,分别饲喂含青贮桑叶为0%(Ⅰ组),10%(Ⅱ组),15%(Ⅲ组),20%(IV组)的日粮,试验期70d,其中预试期10d,正试期60d;饲养试验结束后屠宰,取皮下脂肪、尾部脂肪、肾周脂肪、肝脏、背最长肌组织进行RT-PCR,检测上述基因mRNA表达量。结果如下,PPARγ、ADIPOQ、aP2 mRNA在陕北白绒山羊不同组织部位均有表达,PPARγ、aP2mRNA在皮下脂肪组织表达量显著高于所检测的其他组织(P0.05),ADIPOQ mRNA在脂肪组织的表达显著高于肝脏和肌肉组织(P0.05)。在皮下脂肪组织和肝脏,PPARγ、ADIPOQ、aP2mRNA的表达量I组显著高于其他组(P0.05),不同添加水平的青贮桑叶对其他组织部位PPARγ、ADIPOQ、aP2mRNA的表达量的影响不一致。结果表明,饲喂青贮桑叶能显著影响陕北白绒山羊脂肪代谢相关基因mRNA的表达,青贮桑叶可以作为潜在的具有降脂功效的饲料补充料添加到山羊饲料中以调节脂肪沉积改善肉品质。     

桑叶对绒山羊血脂及脂肪代谢相关基因表达的影响

【目的】探讨日粮中桑叶添加方式和添加量对绒山羊血脂代谢及组织中脂蛋白酯酶(LPL)、脂肪酸合成酶(FASN)、瘦素(Leptin)基因表达量的影响。【方法】选用体况良好(平均体质量(28±1.05)kg/只)的陕北白绒山羊羯羊60只,随机均分为对照组、干桑叶组Ⅰ、干桑叶组Ⅱ、青贮桑叶组Ⅰ、青贮桑叶组Ⅱ、青贮桑叶组Ⅲ6组,其中对照组日粮中不添加桑叶;干桑叶组Ⅰ、Ⅱ日粮中分别添加质量分数10%,15%的自然风干桑叶,青贮桑叶组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组日粮中分别添加质量分数10%,15%,20%的青贮桑叶。饲养试验持续70d。饲养试验结束后,每组随机挑选3只羊进行屠宰,宰前颈静脉采血并分离血清,宰后采集腹部皮下脂肪、肾周脂肪、尾部脂肪、肝脏、背最长肌组织样。测定血清中血脂代谢相关指标;通过实时荧光定量PCR检测各组织中LPL、FASN、Leptin基因表达量。【结果】干桑叶组Ⅱ和青贮桑叶组Ⅱ的血清LDL-C浓度分别显著降低36.4%和30%(P0.05);饲喂干桑叶组羊血清Leptin质量浓度显著降低(P0.05);干桑叶组Ⅱ和青贮桑叶组Ⅲ中血清FASN质量浓度均显著降低(P0.05)。LPL、FASN、Leptin具有组织表达特异性,且日粮中添加桑叶对绒山羊各组织中基因表达的影响不同。肝脏中,干桑叶组Ⅱ和青贮桑叶组Ⅱ中FASN基因表达量显著降低(P0.05);腹部皮下脂肪中,青贮桑叶组Ⅲ的LPL、Leptin基因表达量显著增加(P0.05);肾周脂肪中,LPL基因表达量在青贮桑叶组Ⅱ中显著上升(P0.05);尾部脂肪中,干桑叶组Ⅱ和青贮桑叶组Ⅱ的LPL基因表达量显著增加(P0.05),干桑叶组Ⅱ和青贮桑叶组Ⅲ的Leptin表达量显著增加(P0.05);背最长肌中,青贮桑叶组Ⅱ的LPL、Leptin基因表达量显著上升(P0.05)。【结论】日粮中添加干桑叶和青贮桑叶对绒山羊脂肪代谢均有调控作用,但整体上饲喂青贮桑叶效果更显著;在日粮中添加质量分数15%的青贮桑叶有更好的降血脂效果,降低血液中TC、TG、LDL-C浓度,促进脂肪组织中LPL、Leptin基因表达,抑制肝脏中FASN基因表达。     

基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因及其表达验证

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1 700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833（内肽酶,EC编号：EC3.4.21.53）、gene0196（金属内肽酶,EC编号：EC3.4.24）和gene0585（羧肽酶,EC编号：EC3.4.17.14）以及1个L-天冬酰胺酶基因（gene0683,EC编号：EC3.5.1.1）。以pET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株（100.97 U/mL）显著提高了8.67%（P＜0.01）;L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株（22.79 U/mL）显著提高了30.06%（P＜0.01）。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因（gene0833和gene0683）,均来源于微小杆菌属（Exiguobacterium）,其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L 天冬酰胺酶酶活性。