H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响

【目的】探讨不同质量浓度的左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响.【方法】在成熟培养液中添加不同质量浓度左旋肉碱,观察其对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,并利用油红染色、三酰甘油定量试剂盒和定量RT-PCR技术检测其对卵母细胞脂肪代谢及其关键水解酶表达水平的影响.【结果和结论】在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉碱能极显著促进猪卵母细胞的脂肪滴代谢(P0.001),并显著提高猪卵母细胞体外成熟率和孤雌激活囊胚发育率(P0.05);在胚胎培养液中添加100 ng/mL左旋肉碱能够显著提高猪孤雌胚胎卵裂率(P0.05),其囊胚率和囊胚质量均有提高的趋势;通过定量RT-PCR进一步发现100 ng/mL左旋肉碱极显著降低猪卵母细胞中激素敏感脂肪酶基因(HSL,P0.01)和三酰甘油水解酶基因(ATGL,P0.001)的mRNA表达水平,表明左旋肉碱能够影响调控脂肪代谢关键酶基因的表达.试验结果表明,左旋肉碱具有促进猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的作用,其可能是通过调控脂肪代谢来实现的.     

骨桥蛋白OPN在哺乳动物生殖上的作用及在生猪生产应用上的展望

骨桥蛋白(osteopontion,OPN)是细胞外基质中的一种分泌性糖基类酸性蛋白质,富含天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸。有研究表明,骨桥蛋白在雌性、雄性哺乳动物生殖系统中广泛表达,与哺乳动物的生殖机能息息相关。它不仅影响子宫内膜容受性的建立、胚胎的着床,且在精卵融合过程中发挥着至关重要的作用。就OPN在哺乳动物生殖上的相关作用和机理进行了综述,并对该蛋白今后在生猪生产上的应用进行展望。     

公猪繁殖障碍的表现与致病机理

公猪繁殖障碍是当今养猪业生产中普遍存在的问题,其表现为公猪繁殖能力的下降或缺失。公猪繁殖障碍病主要由传染性因素和非传染性因素造成的,其中由传染性因素引起的繁殖障碍主要是病毒或病菌侵染公猪睾丸所引起的,如乙脑病毒、布氏杆菌、猪衣原体、伪狂犬病病毒等;而非传染因素引起的则多与营养、饲养管理、热应激以及受精相关蛋白含量有关。为了更好地避免公猪繁殖障碍,从繁殖障碍的表现、致病因素及致病机理等方面进行了概述,以供养猪管理人员参考。     

初探lncRNA-Tubb4b的蛋白编码能力及其对微管基因的调控

旨在探索长链非编码Tubb4b基因（lncRNA-Tubb4b）是否具有蛋白编码能力及其对Tubb4b基因的调控作用。本研究在lncRNA-Tubb4b中添加起始密码子ATG、0/1/2个的T尾和Flag标记，通过构建载体、脂质体转染和Western blot等技术对lncRNA-Tubb4b蛋白编码能力进行分析；随后，构建过表达载体和合成siRNA，通过脂质体转染和实时荧光定量PCR等技术检测lncRNA-Tubb4b对微管基因Tubb4b的影响。结果表明，我们扩增了添加0、1和2个T尾的Flag片段，其与lncRNA-Tubb4b融合后，成功构建到pcDNA3.1（-）载体中；转染小鼠精原细胞后发现，添加0、1和2个T尾的lncRNA-Tubb4b均没有FLAG蛋白条带；以pcDNA 3.1（-）-EGFP载体为对照，在小鼠精原细胞中过表达lncRNA-Tubb4b时，对照组细胞有荧光产生，试验组Tubb4b基因的mRNA表达水平极显著地降低（P<0.01）；在小鼠精原细胞中干扰lncRNA-Tubb4b表达后，极显著地提高Tubb4b基因的mRNA表达水平（P<0.01）。这表明，lncRNA-Tubb4b确实不编码蛋白质，过表达或干扰lncRNA-Tubb4b的表达会极显著地降低或升高Tubb4b基因的表达。