Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。     

稀释液中添加L-赖氨酸对杜泊羊鲜精液品质的影响

为了探讨添加不同水平L-赖氨酸的精液稀释液对杜泊羊鲜精液态保存下品质的影响,试验选用健康的杜泊种公羊3只,采集精液,等量分装,分别加入到含不同水平(0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g) L-赖氨酸的120 mL稀释液中,在0、6、24、30、48、54、72和78 h对精子活力、质膜完整率和顶体完整率进行检测。结果表明,添加0、0.1、0.2 g L-赖氨酸组精子活力较其他添加水平组高,添加0.4和0.5 g L-赖氨酸组精子活力下降速度快,添加0.5 g L-赖氨酸组精子活力在30 h时降为0,添加0.4 g L-赖氨酸组精子活力在48 h时降为0;添加0.1 g L-赖氨酸组精子有效存活时间和生存指数最高,与其他组间差异显著(P< 0.05);质膜完整率0.1 g组最高,贮存0~54 h间与对照组间差异不显著(P >0.05),72 h后与对照组间出现显著性差异(P< 0.05),0.4和0.5 g组最差,与其他组间差异显著(P< 0.05);顶体完整率0.1 g组最高,与对照组间差异不显著(P >0.05),0.4和0.5 g组最差,二者差异不显著(P >0.05),除贮存0和6 h外,与其他组间差异极显著(P< 0.01)。结果提示,稀释液中添加高浓度的L-赖氨酸对精液品质有抑制作用,当L-赖氨酸添加水平≥0.2 g,精子品质显著下降,添加0.1 g L-赖氨酸有助于提高杜泊羊鲜精液态保存的品质。     

抗Luman募集因子N端单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗Luman募集因子N端(Luman-recruiting factor N terminal,LRF-N)蛋白的单克隆抗体。【方法】PCR扩增LRF-N端的194bp序列,构建LRF-N重组质粒pGEX-LRF-N,转染BL21(DE3)菌,诱导表达并纯化GST-LRF-N融合蛋白,以其作为抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,免疫4次,每次间隔10d,第4次加强免疫3d后采取小鼠脾脏,分离脾细胞,与SP2/0细胞融合,用ELISA和Western blot进行阳性细胞株的筛选和鉴定,对获得的杂交瘤细胞的细胞核型、分泌稳定性以及所分泌的单克隆抗体进行鉴定。【结果】pGEX-LRF-N在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,GST-LRF-N蛋白分子质量约为33ku,与预期结果一致。试验共获得3株稳定分泌抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2AC9、2AG10和3G7。单抗2AC9、2AG10、3G7能够特异性地识别GST-LRF-N蛋白,亚型鉴定结果显示,其重链分别为IgG2a、IgM和IgG1。【结论】获得的抗LRF-N抗体的杂交瘤细胞株2AC9、2AG10、3G7单抗特异性良好,能够稳定分泌抗体,可用于小鼠LRF蛋白生物学功能及活性的进一步研究。