马铃薯软腐病菌室内药剂及拮抗细菌筛选

由Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense(Pcb)引起的马铃薯细菌性软腐病是马铃薯重要病害之一,在我国马铃薯产区普遍发生,危害严重,其化学防治和生物防治研究和应用较少。以Pcb为指示菌,选择9种常用的细菌药剂,通过室内平板试验,筛选出对Pcb具有抑菌作用的4种药剂,抑菌效果依次为万胜清(20%溴菌腈·5%壬菌铜)、克菌康(3%中生菌素)、辛菌胺醋酸盐和金霉唑(1.5%噻霉酮);进一步从土壤中分离并获得对Pcb有拮抗作用的5个拮抗细菌RFjk1～RFjk5,它们分别与菠萝泛生菌(Pantoea ananatis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)及松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)的16SrDNA序列相似性在99%以上,鉴定为粘质沙雷氏菌的拮抗细菌RFjk2,显示出潜在应用前景,可望为马铃薯细菌性软腐病的化学防治和生物防治奠定基础。     

江西和广东烟草青枯菌对噬菌体的敏感性及聚类分析

为探索不同噬菌体对不同烟草青枯菌的侵染能力,选择从土壤中分离的6个青枯菌噬菌体,通过双层平板噬菌斑检测法,测定6个噬菌体P1521、P1553、P1556-1、P1556-2、P574-2和P7-1对江西和广东两省烟区75个烟草青枯菌的侵染和裂解情况,并基于青枯菌对3个噬菌体的敏感性差异,进一步对75个青枯菌进行聚类分析。结果表明:6个噬菌体分别可侵染65、63、61、57、57和24个烟草青枯菌菌株,噬菌体P1556-1和P1521寄主范围较广,噬菌体P1553寄主范围较窄;基于P1556-1、P574-2和P1553等3个噬菌体,对75个青枯菌进行聚类分析,将75个烟草青枯菌分为7个遗传组(Rs-I~Rs-VII),其中Rs-IV菌株数量较多,包括31个青枯菌,占供试菌株的41.33%,这些菌株对P1553噬菌体均表现不敏感,而对其它2个噬菌体敏感。     

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ~(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。     

4种噬菌体对寄主青枯菌的敏感性及作用受体分析

【目的】明确不同噬菌体混合对茄劳尔氏菌(青枯菌)Ralstonia solanacearum裂解能力和对噬菌体抗性产生的影响,了解4种噬菌体的作用受体。【方法】将4种噬菌体P1556-1、P1556-2、P7-1和P1521两两混合后,比较其在青枯菌平板上产生的噬菌斑大小;噬菌体与青枯菌混合培养测定青枯菌对噬菌体的抗性;通过噬菌体与脂多糖和膜蛋白的吸附试验测定噬菌体的作用受体。【结果】噬菌体P1556-1产生的噬菌斑最大,裂解青枯菌的能力强。4种噬菌体两两混合产生的噬菌斑与单一噬菌体产生的噬菌斑大小没有显著差异,但可延缓抗噬菌体的青枯菌产生。噬菌体P1556-2可被青枯菌的脂多糖吸附,P1521能被脂多糖和膜蛋白吸附,而P1556-1和P7-1均不能与脂多糖和膜蛋白作用。【结论】不同噬菌体混合不能提高其裂解青枯菌的能力,但可以延缓抗性青枯菌的产生;不同噬菌体作用受体不同。     

烟草青枯病菌噬菌体分离及其生物学特性研究

【目的】烟草青枯病是我国南方烟区发生普遍而严重的细菌病害,目前尚未有理想的化学防治药剂,筛选青枯病菌噬菌体,为作物青枯病的防治提供噬菌体资源。【方法】从江西省吉安市烟田采集土壤样本,采用双层平板培养分离方法,分离青枯菌噬菌体,进一步比较物理和化学因素对噬菌体活性的影响。【结果】从吉安烟田土壤中分离获得6个青枯菌噬菌体,编号为PTb7-1、PTb1521、PTb1553、P1Tb1556、P2Tb1556和PTb574,其生物学特性存在差异。结果显示,多个噬菌体的最适生长温度约为35℃,致死温度为55～60℃,适宜酸碱度为pH 5～9,且对紫外光、乙醚和氯仿敏感。然而,噬菌体PTb7-1只适合于酸性环境条件下生长繁殖,噬菌体P2Tb1556对紫外光和乙醚不敏感,但对氯仿敏感。【结论】烟草土壤中具有丰富的青枯菌噬菌体资源,是筛选噬菌体的材料来源。6个青枯菌噬菌体生物学特性存在差异,噬菌体P2Tb1556对紫外光和乙醚不敏感,但对氯仿敏感。