冰岛硫化叶菌xpb基因缺失突变体的构建及遗传学分析

为在体内研究古菌核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)机制,利用基因敲除的方法,对泉古菌核苷酸切除修复机制进行研究,构建了冰岛硫化叶菌编码真核生物NER解旋酶XPB同源蛋白的基因xpb1和xpb2单缺失突变体,从而在体内分析xpb1和xpb2基因的功能。结果表明:基因xpb1或xpb2不是冰岛硫化叶菌存活的必需基因。表型分析发现,xpb1和xpb2基因单缺失突变体相较野生型菌株REY15A,对DNA损伤试剂4-NQO 4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4-NQO)分别表现出轻微敏感性和不敏感性,暗示NER解旋酶功能在冰岛硫化叶菌体内存在多重冗余。     

大豆等豆科植物快生型根瘤菌的分离比例、质粒类型及共生反应

本文对大豆、野大豆、花生、大翼豆等寄主植物的根瘤菌进行分离鉴定。结果表明,从几种寄主根瘤中分离出的快、慢生型菌株大约各占一半。在供试寄主植物上表现有效共生的菌株比例,慢生菌大于快生菌。大豆快生型菌株的质粒类型具多样性,按质粒图可分为26组。10种不同质粒类型代表菌株与太兴黑豆(与慢生菌广谱有效共生)有选择性地有效结瘤固氮,而与矮脚早(与慢生菌特异性有效共生)非选择性地有效结瘤固氮。     

泉古菌Sulfolobus islandicus PCNA1的原核表达及其多克隆抗体的制备

泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。     

硫化叶菌超表达载体构建及Mre11的表达

利用araS启动子并在穿梭载体pZC1及pEXA的基础上构建硫化叶菌超表达载体pZC2,成功超表达了带有C端6×His标签序列的DNA双链断裂修复蛋白Mre11,进一步采用共纯化法鉴定到Mre11蛋白的作用配体Rad50,确定上述蛋白在高浓度盐(500mmol/L NaCl)中仍能形成MR复合体,表明该复合物在逆性条件下可能仍保持DNA断链修复的功能。进一步共纯化分析表明,基因组DNA片段是MR复合体形成的必需条件,在缺乏基因组DNA片段的情况下古菌分子伴侣蛋白结合并可能保护Mre11,该表达系统能够有效地应用于鉴定蛋白质的体内作用网络。     

冰岛硫化叶菌反螺旋酶基因的遗传学分析

根据同源重组的原理,构建了用于敲除冰岛硫化叶菌中反螺旋酶(RG)基因的质粒pRG.重组质粒反复转化冰岛硫化叶菌,得到质粒整合到宿主染色体上的单交换菌株,但没有获得反螺旋酶基因缺失的双交换转化子.由此推测反螺旋酶基因是冰岛硫化叶菌必需的功能基因,敲除反螺旋酶基因可导致细胞死亡,或者转化菌株为生存需要存在某种未知机制而阻止双交换发生.单交换菌株可以再次发生同源重组,通过PCR的方法,证实再次重组得到的皆为回复突变而无缺失突变菌株.