水分胁迫下马铃薯基因组DNA甲基化水平变化分析

DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要研究内容之一,在植物生长发育和响应逆境胁迫等过程中起重要作用,其中水分胁迫是对植物生长发育最具危害的逆境胁迫之一。为探索马铃薯DNA甲基化与水分胁迫之间的关系,本研究采用PEG-6000模拟水分胁迫处理两个马铃薯品种‘青薯9号’和‘大西洋’,在PEG0%(对照),5%和10%浓度下,利用MSAP技术检测‘青薯9号’和‘大西洋’甲基化水平变化情况。结果表明:在相同条件下,抗旱型品种‘青薯9号’甲基化水平高均于干旱敏感型品种‘大西洋’。在0%(对照)、5%和10%PEG胁迫下,‘青薯9号’MSAP比率为42.49%、38.14%、49.21%,甲基化水平与对照相比先降低后升高,‘大西洋’MSAP比率29.17%、22.92%、17.58%,甲基化水平逐渐降低。经统计,5%PEG和10%PEG胁迫下,‘青薯9号’和‘大西洋’均出现甲基化和去甲基化现象,其中‘青薯9号’甲基化和去甲基化比率分别为10.92%、6.43%和11.98%、15.36%,‘大西洋’分别为1.59%、8.22%和42.18%、24.34%,甲基化变异模式以去甲基化为主。‘青薯9号’和‘大西洋’均能发生CNG、CG和CG/CNG位点的甲基化和去甲基化,在水分胁迫下会产生较多的CNG和CG/CNG位点。本研究结果为探究马铃薯抗旱机制提供了理论基础。     

二倍体及四倍体枳橙DNA甲基化变异的MSAP分析

为探讨染色体加倍对四倍体枳橙(Citrus sinensis (L.) Osb.×Poncirus trifoliate (L.) Raf.)叶片基因组DNA甲基化修饰的影响,明确四倍体枳橙基因组DNA甲基化水平及模式的变化特征。本研究以枳橙二倍体为对照,利用MSAP分子标记技术对同源四倍体枳橙叶片基因组DNA甲基化水平及模式变化进行分析。结果表明,10对选择性扩增引物共扩增出775条条带,二倍体和同源四倍体枳橙扩增带数分别为391条和384条,对应的总甲基化率分别为31.97%(含全甲基化率16.37%,半甲基化率15.6%)和31.25%(含全甲基化率18.49%,半甲基化率12.76%);MSAP扩增条带统计表明,同源四倍体的总甲基化率变化较小,全甲基化率高于二倍体,半甲基化率较二倍体均有所降低,相比二倍体对照,四倍体枳橙叶片基因组DNA主要发生了甲基化模式的变化。     

拟南芥组蛋白甲基化酶SUVH6中SRA结构域基因的克隆及表达

[目的]研究甲基化修饰对遗传基因调节的作用。[方法]利用拟南芥RNA反转录得到的cDNA序列为模板,克隆出SUVH6-SRA基因,并成功构建了含有SUVH6-SRA基因的表达载体pMAL-c2P-SUVH6-SRA,然后将pMAL-c2P-SUVH6-SRA质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,诱导表达带有MBP标签的SUVH6-SRA融和蛋白。[结果]pMAL-c2P-SUVH6-SRA克隆在转化到大肠杆菌BL21（DE3）后,在37℃条件下,经过终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导,大肠杆菌BL21（DE3）能够获得大量可溶性MBP-SUVH6-SRA融和蛋白并顺利表达,SDS-PAGE显示诱导表达的融和蛋白相对分子质量为66.0 kDa左右,与预测的结果相吻合。[结论]在MBP与目的蛋白之间引入了PPE酶切位点,可使MBP和SUVH6蛋白分离,并在使用MBP亲和层析和PPE酶切后,获得了纯度较高的SUVH6蛋白,表明成功构建了SUVH6-SRA-MBP融和蛋白原核表达系统。     

家鸡胚胎发育过程DNA甲基化的MSAP检测

[目的]检测鸡胚不同发育阶段时的DNA甲基化水平。[方法]以不同发育阶段的家鸡胚胎为试验材料,提取基因组DNA,采用甲基敏感扩增片段多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术对其甲基化水平进行了初步检测。[结果]共发现甲基化位点880个,CCGG位点单链外侧的胞嘧啶甲基化位点比例为20．48％,双链CCGG位点的内侧胞嘧啶甲基化19．30％,两者总比例为39．78％。[结论]鸡胚发育过程,DNA甲基化随着胚胎的发育呈升高趋势。     

瓜实蝇DNA甲基化的MSAP体系建立与优化

瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae (Coquillett)]是中国重要的蔬菜害虫,但其DNA甲基化研究尚未见报道。甲基化敏感扩增多态性是研究DNA甲基化的重要技术之一。通过对酶切反应、连接、PCR扩增和引物筛选等条件优化,建立瓜实蝇MSAP反应体系,即：①20 μL酶切体系中加入10 U的限制性内切酶与600 ng基因组DNA,于37℃酶切反应过夜;②20 μL连接体系中加入T4 连接酶1 U,HpaⅡ-MspⅠ-adapter接头50 pmol,EcoR I-adapter接头5 pmol,并于16℃反应12 h;③连接产物稀释后进行PCR预扩增和选择性扩增,再经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测结果。通过该体系筛选出适用于瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性研究的6对引物;瓜实蝇MSAP体系为瓜实蝇的表观遗传学研究提供了技术支持。     

野生和“黄海1号”中国明对虾不同组织基因组DNA的MSAP分析

为了从表观遗传学角度讨论中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)野生群体和人工选育新品种“黄海1号”不同组织间甲基化水平和多态性差异,应用甲基化敏感扩增多态性(mehylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)分别对野生群体组中国明对虾和“黄海1号”肌肉、鳃、血液3种组织样品基因组DNA的CCGG甲基化水平进行对比分析,试图从表观遗传学角度探讨影响中国明对虾生长性状的分子机制.采用30对引物进行选择性扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)带型结果显示,野生群体组中国明对虾肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为23.1%,22.3%和19.7%;而“黄海1号”肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为21.4%、19.6%和18.9%.野生群体组中国明对虾和“黄海1号”同一组织间的甲基化水平和甲基化多态性水平不同,肌肉、鳃和血液不同组织间的甲基化水平和甲基化多态性水平亦不同.DNA 甲基化多态性带型分析显示,鳃组织的甲基化水平和多态性水平在野生群体组中国明对虾和“黄海1号”间变化趋势最大,肌肉最稳定.本研究旨为甲基化修饰与中国明对虾生长性状间的相关性研究提供依据.     

肝癌细胞系中Runx3基因表达及启动子区异常甲基化分析

目的：通过检测6种肝癌细胞中Runx3基因异常甲基化状态及表达情况,探讨药物5-aza-2＇-deoxycytidine（decitabine）激活Runx3基因重新表达的能力及对肝癌细胞生长的影响。方法：采用DNA甲基化特异性PCR（MSP）技术分别对6种肝细胞癌细胞系Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测,同时采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测5种肝癌细胞中Runx3的表达情况及药物5-aza-2＇-deoxycytidine处理其中3种肝癌细胞前后Runx3表达变化。结果：6种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常,药物5-aza-2＇-deoxycytidine处理3种肝癌细胞后,Runx3基因明显表达或表达活性增强。结论：启动子区异常甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。