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1.
[目的]对牛冠状病毒N蛋白进行原核表达,利用指数富集的配基系统进化技术筛选N蛋白的核酸适配体,为该病诊断方法的建立奠定基础.[方法]根据牛冠状病毒基因序列,设计N蛋白编码基因特异性引物,扩增目的基因并通过酶切、连接、转化构建原核表达载体pET-28a-N,优化N蛋白表达条件,镍柱纯化获得高纯度高浓度的N蛋白.利用微孔板法,经过包被、封闭、加文库、洗脱、提取、PCR、胶回收和反筛等步骤从原始核酸适配体文库中筛选出N蛋白特异性适配体,连接T载体转入DH5a感受态细胞后,经菌落PCR鉴定和测序获得与N蛋白特异性结合的适配体序列,测定其结合常数,并利用在线软件预测其二级结构.[结果]成功表达出约55 kD的重组蛋白;经微孔板法筛选出67条适配体序列,其中N-12、N-33和N-45出现多次重复,经测定3条核酸适配体均具有环状、发卡结构,利于与目标蛋白稳定结合.[结论]筛选的3条核酸适配体有望用于牛冠状病毒病早期诊断用酶联适配体方法的建立.  相似文献   
2.
[目的]为了获得重组柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白.[方法]根据Genebank设计柔嫩艾美耳球虫微线4N端基因特异引物,RT-PCR扩增该基因,经Blast与Genebank公布的该基因比对,而后构建该蛋白的真核表达载体pPICZaA/EtMIC4N,用毕赤酵母表达系统小规模表达该蛋白,利用SDS-PAGE和Western Blot对表达的蛋白鉴定,再以摇瓶的方式进行大规模表达.[结果]RT-PCR扩增获得柔嫩艾美耳球虫微线4N端基因序列,大小为773 bp,经比较,与目的基因开放阅读框相似度99.5%,其中有4个碱基发生突变,1个gap.PCR证实成功构建真核表达载体,电转后的毕赤酵母用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot发现在上清中有45 kD的条带,说明成功表达该蛋白,且该表达系统可持续获得较高纯度的目的蛋白,以摇瓶的方式进行大规模表达,每升能够纯化到约10 mg的目的蛋白.[结论]毕赤酵母成功表达重组柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白,为该蛋白免疫原性的研究奠定基础.  相似文献   
3.
2021年1月,江苏省连云港市云台山景区云台街道西隅水库发生一起疑似野禽H5N8亚型禽流感疫情,共17只鸳鸯、大雁感染死亡。江苏省动物疫病预防控制中心迅速组织相关人员,指导连云港市按照国家相关方案和规范要求,开展现场调查、实验室诊断和应急处置工作。经江苏省动物疫病预防控制中心初诊,国家禽流感参考实验室确诊,诊断为H5N8亚型高致病性禽流感疫情。同时,指导当地政府划定疫点、疫区和受威胁区,封锁相关区域,开展应急监测、紧急流行病学调查、全面消毒等应急处置工作。经果断处置,疫情得到了有效控制,未造成扩散和蔓延。本次疫情提示:野禽疫情的早期发现和及时控制对于降低疫情扩散风险至关重要;林业和农业农村部门的沟通协作要继续加强,日常的禽流感监测力度需要进一步加大,家禽的禽流感疫苗免疫要更加科学,群众的禽流感防控意识要持续提高。  相似文献   
4.
NMB/NMBR通过调节A型流感病毒(IAV/H1N1/PR8)感染诱导的细胞因子表达而参与抗IAV的先天性免疫反应。为探究其发挥抗IAV/H1N1感染的信号通路,本文用PR8和WSN毒株分别感染MLE-12细胞和小鼠,用NF-κB抑制剂BAY11-7028单独或联合NMB处理MLE-12细胞,小鼠后腿肌内注射NMB和NMBRA,采用RT-PCR和qRT-PCR分析NMBNMBRIL-6、IFN-α和NP基因表达变化,采用Western blot分析NMB、NMBR、P65/p-P65、IκBα和NP蛋白表达的变化。结果显示,BAY11-7028可促使PR8和WSN感染的MLE-12细胞中NMB、NMBRIL-6和IFN-α基因表达水平均下降和NP基因表达水平上升,并降低NMB、NMBR和p-P65蛋白表达水平和提升IκBα和NP蛋白表达水平。然而,NMB联合BAY 11-7028诱导PR8或WSN感染后的细胞中IL-6和NP表达出现极显著下降和IFN-α显著上升。此外,NMB抑制PR8和WSN感染的小鼠肺组织内p-P65和NP蛋白表达水平和促进IκBα蛋白表达水平;NMBRA联合NMB抵消NMB对PR8或WSN感染后的这些蛋白表达水平的调节作用。综上表明,NMB/NMBR通过调节PR8和WSN感染的MLE-12细胞和小鼠体内的NF-κB信号通路上P65蛋白磷酸化和IκBα的表达,进而影响下游细胞因子IL-6和IFN-α基因的表达,从而发挥抗IAV/H1N1感染的先天性免疫应答反应。  相似文献   
5.
为了给猪流感疫苗的研制做准备,试验将从某猪场现地采集疑似猪流感发病猪的鼻拭子样品,经过处理后接种至10~11日龄SPF鸡胚进行盲传,分离到1株具有血凝性的病毒。通过血清学、分子生物学鉴定、电镜观察、动物回归试验等方法对该病毒进行鉴定。结果发现:该病毒可与猪流感病毒H3亚型阳性血清特异性结合;通过分子生物学检测,该分离株出现猪流感病毒H3亚型和N2亚型目的片段;将该分离株液置于电镜下观察可见直径为80~120 nm且具有囊膜和纤突的病毒粒子,符合猪流感病毒粒子形态特征;用纯化后的病毒攻击4~6周龄阴性仔猪,攻毒组仔猪发病率可达80%。由此可见分离获得的病毒为H3N2亚型猪流感病毒。  相似文献   
6.
为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×101~3.31×107拷贝·μL-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×101拷贝·μL-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为106.7、105.3拷贝·mL-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。  相似文献   
7.
地膜覆盖与施肥对秸秆碳氮在土壤中固存的影响   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】作物秸秆不仅含有较高的有机碳,而且含有丰富的矿质营养元素。秸秆还田是东北黑土地区培肥土壤和农业可持续发展的重要技术措施。然而不同地膜覆盖(简称“覆膜”)及施肥方式下秸秆碳(C)和氮(N)在土壤中的固持特征还不是很明确。本研究通过定量分析秸秆碳对土壤有机碳(SOC)和秸秆氮对土壤全氮(TN)的贡献,探讨不同覆膜和施肥条件下秸秆碳和氮在土壤中固定的差异,以期为土壤肥力提升和东北黑土地保护提供依据。【方法】基于覆膜与施肥的长期定位试验,选择覆膜和不覆膜(裸地)栽培条件下不施肥(CK)、单施氮肥(N4)和有机肥配施氮肥(M2N2)处理,在表层(0—20 cm)土壤添加13C15N双标记秸秆后在田间原位培养150 d,测定SOC含量及其δ13C值、TN含量及其δ15N值,分析SOC中秸秆来源C(13C-SOC)、TN中秸秆来源N(15N-TN)和土壤碳氮比随时间的动态变化特征。【结果】施肥、覆膜及其它们的交互作用显著影响(P<0.05)13C-SOC和15N-TN含量。整个培养期间,M2N2处理秸秆碳对SOC的贡献率(13C-SOC/SOC)和秸秆氮对TN贡献率(15N-TN/TN)平均分别为10.48%和3.18%;施肥(N4和M2N2)处理13C-SOC/SOC和秸秆碳残留率在覆膜方式下平均分别为12.65%和37.14%,不覆膜方式下分别为12.08%和34.50%。同一栽培方式培养第150天,N4处理13C-SOC/SOC和秸秆碳残留率平均分别为14.33%和39.40%,其他施肥处理平均分别为11.77%和33.21%;CK处理15N-TN/TN平均为4.56%,分别比N4和M2N2处理高26.00%和44.53%。培养第150天,秸秆氮残留率在覆膜和不覆膜条件下CK处理最高,平均为10.03%;不覆膜N4处理最低,为7.87%。无论覆膜与否,N4处理13C-SOC与15N-TN比值为32—39,其他施肥处理均<30。【结论】秸秆碳氮在土壤中的固存对覆膜与施肥的响应敏感。单施氮肥有利于秸秆碳在土壤中的积累和有机碳的更新,不施肥处理秸秆氮对土壤氮库的固定起正反馈效应,而有机肥配施氮肥土壤碳氮的更新相对滞后。  相似文献   
8.
Groundwater forms the main freshwater supply in arid and semi-arid areas,and contamination of this precious resource is complicated by the slow rate of recharge in these areas.Nitrate contamination of groundwater is a global water quality problem,as it entails threat to human health as well as aquatic ecosystems.Source identification of contamination is the cornerstone and a prerequisite for any effective management program of water quality.Stable isotope composition of the dissolved nitrate(δ15N-NO3-andδ18O-NO3-)has been applied to identify NO3-sources and the main transformation processes in the upper aquifer system(A1/2,A4,and B2/A7 aquifers)in the Wadi Shueib catchment area,Jordan.Moreover,the stable isotope compositions of the groundwater(δ2H-H2O andδ18O-H2O)in conjunction with the groundwater hydrochemistry were integrated to investigate the origin and evolution of the groundwater.Results revealed that groundwater in the study area is fresh and hard-very hard water,and mainly a Ca-Mg-Cl type.NO3-concentration was in the range of 7.0-74.0 mg/L with an average of 37.0 mg/L.Most of the samples showed concentration higher than the natural background concentration of NO3-(5.0-10.0 mg/L).Theδ2H-H2O andδ18O-H2O values indicated that the groundwater is meteoric,and of Mediterranean origin,with a strong evaporation effect.Theδ15N-NO3-values ranged between 6.0‰and 11.3‰with an average of 8.7‰,and theδ18O-NO3-values ranged between 1.6‰and 5.9‰with an average of 3.4‰.These values are in conformity with the stable isotope composition of nitrate derived the nitrification of wastewater/manure,and soil NH4.Nitrification and denitrification are the main transformation processes affecting nitrogen species.Statistical analysis revealed no significant differences in theδ2H-H2O andδ18OH2O values,andδ15N-NO3-andδ18O-NO3-values for the three aquifers(A1/2,A4,and B2/A7),indicating that the groundwater of these aquifers has the same origin,and a common source of pollution.  相似文献   
9.
红河干热河谷林草地红壤中优先流的形态分布特征   总被引:1,自引:0,他引:1  
[目的] 在红河干热河谷地区开展优先流形态分布特征及与红壤特性关系的研究,为区域水资源管理和防治水土流失等工作提供理论依据。[方法] 以干热河谷地区典型植被林地和荒草地为研究对象,采用野外染色示踪法并结合图像处理技术研究优先流的形态分布特征及对红壤特性响应。[结果] ①林草地上层剖面平均染色面积分别为87.20%和91.97%,染色面积随土层的增加而减小,局部深度内染色面积出现反弹现象;林草地优先流长度指数分别为766.8%和730.0%,林地土壤优先流较荒草地发达;林草地的最大染色深度分别为40 cm和35 cm;②染色路径宽度随土层的增加而减小,0—20 cm土层内以大于250 mm的路径为主,20—40 cm内的染色路径在20—250 mm,而在40 cm以下的土层染色路径集中在20 mm以内;③优先流染色面积比、长度指数、染色路径宽度与土壤因子存在显著相关性,总孔隙度、有机质、含水率等对染色面积比(DA)、长度指数(LI)、染色路径宽度(SPW)累积贡献率分别为97.80%,86.95%,87.45%;含水率、有机质、容重、总孔隙度和Al3+等因子与染色面积比、染色路径宽度呈最优线性关系。[结论] 土壤的孔隙特性、盐基离子和土壤质地等的共同作用最终导致红河干热河谷林草地优先流的差异。  相似文献   
10.
以福建省福州市滨海沙地湿地松(Pinus elliottii)人工林为研究对象,采用同位素质谱仪测定不同叶龄(当年生、1年生、2年生)针叶碳氮同位素丰度值(δ13C、δ15N),然后运用δ13C值来估算碳同位素分辨率(△13C)和水分利用效率(WUE),研究叶龄对湿地松针叶碳氮稳定同位素组成、△13C、WUE的影响,从而为滨海沙地湿地松人工林的科学经营提供依据.结果 表明:C3植物湿地松针叶的δ13C、δ15N、△13C、WUE的平均值分别为(-2.9323±0.0897)%、(-0.4752±0.0245)%、(2.1224±0.0944)%和(30.842±5.038) μmol·mol-1,但是叶片的δ13C、δ15N值均低于全国平均值,而且δ15N值偏负.叶龄对δ13C、δ15N、△13C、WUE均有显著影响(P<0.05),其中δ13C、δ15N、WUE随叶龄增加而降低,△13C随叶龄增加而增加.湿地松针叶的δ13C与δ15N呈极显著线性正相关(y=3.553x-1.244,R2=0.945,P<O.001).  相似文献   
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