Flag-ALD融合载体构建及蛋白表达

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是感染鱼类的最常见致病菌之一，为了解维氏气单胞菌中丙氨酸脱氢酶（alanine dehydrogenase，ALD，EC 1.4.1.1）的调控功能，笔者通过分子克隆获得 Flag-ALD 融合表达载体，并在大肠杆菌中大量表达该蛋白。即以维氏气单胞菌C4基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增获得N端带有Flag标签的ald基因，将带有标签的目的基因与原核表达载体pACYCDuet连接，并将重组质粒pACYCDuet-Flag-ald 转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中。添加异丙基?β?D?1?硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导重组蛋白大量表达。SDS-PAGE分离与Western blot结果表明，来源于维氏气单胞菌的Flag-ALD重组蛋白在E.coli中以可溶性形式成功表达。本实验构建的Flag标记靶标蛋白可为研究丙氨酸脱氢酶在维氏气单胞菌中的功能以及在生物抑菌剂方面的应用提供技术支持。     

棉花根系和叶片质外体汁液分离方法的改进

质外体汁液(apoplastic washing fluid, AWF)在植物生长发育和抵抗生物及非生物逆境方面发挥着重要作用。目前普遍采用真空渗透离心法提取质外体汁液,但具体提取流程和条件却因植物培养条件、种类和器官等不同而不同。本试验以营养液培养的棉花幼苗为材料,改进了棉花根系和叶片AWF分离的取样方法、渗透条件和离心参数等。结果表明,相对于通常的非整体取样,改良后整体取样简单易操作且显著降低了质外体与共质体的苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)活性比值,更适宜开展质外体汁液组分研究。根据真空渗透鲜重增加和AWF稀释因子,进一步证明根系不用真空渗透;而叶片需真空渗透,适宜真空强度/时间为-60 kPa/1min,真空后恢复到正常压强约110s。证明叶片颜色变深面积可作为判定真空渗透强度或时间是否适宜的一种简易可行方法。最后,AWF体积、质外体与共质体的可溶性蛋白含量比值和MDH活性比值综合分析表明,棉花根系适宜离心力大小/时间长度为800×g/10～20 min,叶片为400×g/5 min。本改进方法为棉花AWF组分,如蛋白质组学和代谢组学等研究结果的准确性和可靠性奠定了基础,为其他作物AWF分离方法的优化提供了参考。     

谷子MDH基因非生物逆境响应特性研究

为揭示谷子MDH基因对逆境胁迫的响应,本研究通过序列比对得到2个谷子苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)基因SiMDH1、SiMDH2,并对SiMDH1和SiMDH2的编码蛋白特征、基因结构、功能、进化等性状进行了系统的分析和预测,用荧光实时定量PCR(qPCR)检测了SiMDH1和SiMDH2在苗期不同逆境及关键生育期干旱胁迫和不同光照强度下的表达。蛋白特征参数和序列分析表明,SiMDH1和SiMDH2蛋白特征参数相似度很高,序列非常保守,都含有MDH基因的特征功能域苹果酸酶NAD结合域和苹果酸酶C端功能域。亚细胞定位预测显示,SiMDH1和SiMDH2主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体。启动子区域顺式元件分析发现,在SiMDH1和SiMDH2启动子区域含有大量光应答、激素类和其他类应答元件。苗期逆境qPCR表达谱分析发现,SiMDH1和SiMDH2受脱落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)、高盐和低温不同程度诱导,揭示SiMDH1和SiMDH2参与了谷子苗期非生物逆境胁迫应答。进一步分析发现,SiMDH1和SiMDH2参与了谷子在拔节、抽穗、灌浆期的干旱应答,而光照强度会显著影响SiMDH1和SiMDH2基因在不同生育期的表达。本研究为进一步分析MDH逆境应答机制以及利用基因工程方法改善作物抗逆性提供了试验和理论支持。     

蚯蚓防控西瓜枯萎病的效果及其机理探索

为了探明蚯蚓对西瓜枯萎病的影响机制,开拓西瓜枯萎病防控的新思路,本试验以西瓜连作土壤为基质,采用盆栽试验,研究不同密度的威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)和赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)对西瓜长势、枯萎病发病率的影响,结合西瓜专化型尖孢镰刀菌数量、土壤微生物总量(土壤微生物量碳含量)、土壤微生物活性(土壤脱氢酶活性)以及土壤总酚酸的动态变化,探索蚯蚓对西瓜植株枯萎病的防控机理。结果表明,西瓜定植后45 d,试验组的西瓜蔓长、鲜质量较不投放蚯蚓对照分别增长了18.57%～67.27%、39.29%～87.24%。西瓜定植后30 d、45 d,对照的西瓜植株枯萎病发病率分别为62.15%、85.32%,显著高于蚯蚓试验组(P0.05)。在一定范围内增加蚯蚓密度能有效促进西瓜生长,减缓枯萎病发生。在蚯蚓质量相同的情况下,威廉环毛蚓的促生防病效果优于赤子爱胜蚓。0～45 d的试验过程中,试验组土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)数量、总酚酸含量较对照分别下降了36.63%～69.39%、31.0%～77.4%,45 d时试验组的土壤微生物量碳含量、土壤脱氢酶活性较对照分别提高了115.10～175.71 mg/kg、1.41～2.40μg/(g·h)。蚯蚓能有效降低西瓜植株枯萎病的发病率,促进植株生长,其防控机理可能为:蚯蚓的穴居、取食等活动直接抑制土壤中尖孢镰刀菌的快速繁殖,同时蚯蚓通过降解土壤化感物质(总酚酸),提升微生物总量和活性等方式调控土壤微生物群落结构,改善土壤微生态环境,从而有效防控西瓜枯萎病的发生。     

蛋白质变性剂和金属离子对中华皮蝇单体乳酸脱氢酶活力的影响

为了分析蛋白质变性剂和金属离子对从中华皮蝇(Hypoderma sinense)幼虫中纯化的单体乳酸脱氢酶(LDH)活力的影响,分别用3种蛋白质变性剂[尿素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠(SDS)]以及8种二价金属离子在体外处理纯化的中华皮蝇LDH,再测定其酶活力。结果表明,中华皮蝇LDH对蛋白质变性剂尿素有一定的耐受性,对SDS敏感;在1~20 mmol/L浓度范围内,大多数二价金属离子对LDH活力有不同程度的抑制作用,但3 mmol/L的Co2+对LDH活力有很强的促进作用,这不同于其他来源的LDH。该研究结果提示中华皮蝇LDH具有较高的抗变性能力,对高浓度Co2+的需求可能是其重要特征之一。     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

‘蜂糖李’果实发育过程中有机酸含量变化及其与苹果酸代谢相关酶的关系

【目的】明确‘蜂糖李’果实有机酸组成与含量特点,揭示其发育过程中有机酸含量的变化规律及其与苹果酸代谢相关酶的关系,阐明有机酸积累的关键时期和关键酶。【方法】以‘蜂糖李’及对照‘四月李’为材料,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatograph,HPLC)分析测试李果实发育过程中有机酸组分及含量,并测定苹果酸代谢相关酶的活性。【结果】利用高效液相色谱分析李果实中有机酸组分及含量,发现‘蜂糖李’果实成熟时总酸含量(ω,后同)为5.94 mg·g-1,包括苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、莽草酸和琥珀酸6种,其中以苹果酸含量最高(占总酸含量的88%),‘四月李’果实中有机酸组分与‘蜂糖李’一致,均属于苹果酸型。2个李品种果实中总酸含量的差异主要是由苹果酸含量的差异所致。通过分析李果实发育过程中有机酸含量的变化,发现‘蜂糖李’果实中苹果酸含量大量积累的关键时期在果实发育前期,整体呈先增加后降低的趋势,草酸、酒石酸含量逐渐降低,而柠檬酸含量逐渐升高。与‘四月李’相比,‘蜂糖李’果实中苹果酸、草酸、酒石酸及总酸含量的变化趋势与之一致,且苹果酸及总酸含量在整个过程中均显著低于‘四月李’,而柠檬酸含量的变化趋势与之相反。最后通过分析苹果酸含量与相关代谢酶活性之间的相关性,表明‘蜂糖李’果实中苹果酸在果实发育前期大量积累主要是该时期磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性增强促进了苹果酸的大量合成以及NADP-苹果酸酶(NADP-ME)活性降低减少苹果酸的分解,与NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)关系不大,而‘四月李’苹果酸积累的关键酶是NAD-MDH。在果实发育后期,‘蜂糖李’及‘四月李’NADP-ME活性迅速升高,前者PEPC活性减弱,后者NAD-MDH活性下降,使得2者果实中苹果酸的降解大于合成而呈降低趋势。【结论】‘蜂糖李’是以苹果酸为主要有机酸的低酸型李品种,其果实中苹果酸积累的关键时期为果实发育前期,苹果酸含量的变化由PEPC和NADP-ME协同调控,而对照‘四月李’由NAD-MDH和NADP-ME起主要的调控作用。     

低温对2种紫草科植物△6 脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

以紫草科植物新疆软紫草(Arnebia euchroma)和假狼紫草(Nonea capsica(willd.)G.Don)为材料,翻译延伸因子EF1a为内参基因,利用半定量逆转录聚合酶链式反应(semi-RT-PCR)技术,对2种紫草植物中γ-亚麻酸合成关键酶基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的表达进行研究。结果表明,△6-脂肪酸脱氢酶基因在紫草植物的叶、茎、根中均表达,在低温诱导不同时间后紫草植物叶片中△6-脂肪酸脱氢酶基因的表达有所增强。气相色谱分析显示,其产物γ-亚麻酸在低温下积累,推测紫草科植物叶片中△6-脂肪酸脱氢酶基因表达量增加可能与适应低温胁迫的逆境有关。