瓜菜类病原细菌耐药外排泵RND研究进展

近年来,瓜菜类作物病原细菌的耐药性日益增强,增加了瓜菜相关病害防治的难度。存在于瓜菜作物病原细菌中的外排泵耐药结节分化家族(RND)与细菌的耐药性及细菌/植物互作关系密切。笔者根据有关文献综述了RND外排泵的结构与功能、细菌/植物互作过程中外排泵的作用以及外排泵抑制剂(EPIS)的相关研究进展,为瓜类和蔬菜类作物病原细菌耐药性的研究提供参考。     

外排泵基因在志贺菌分子分类中的应用

志贺菌属(Shigellae)是感染性腹泻的重要病原菌之一,志贺菌H24是临床多耐药株.在H24的分类过程中,发现血清分型和16S rRNA分类都有一定的局限性,16S rRNA不能直接把H24鉴定至种,通过分析H24外排泵基因emrE、cmr、ydhE、acrB基因序列信息,尝试利用外排泵的基因序列信息对志贺菌进行鉴定分类.结果表明,H24外排泵基因emrE、cmr、acrB和ydhE具有很强的进化保守性,未发现染色体上的外排泵基因在不同种属之间有明显的水平转移痕迹,对志贺菌仅用16S rRNA基因序列信息连属的分类都不能做到,但结合emrE和cmr的基因序列信息可直接将志贺菌鉴定到种,首次提出以外排泵基因为分子靶标对志贺菌和大肠杆菌进行快速分类的方法.     

空肠弯曲菌耐药机制研究进展

空肠弯曲菌是一种全球关注的人兽共患病病原菌,由于滥用抗生素而造成其耐药性不断增强,成为公共卫生日益关注的问题.各类抗生素作用位点的基因突变是诱发空肠弯曲菌对各类临床常用的抗生素产生耐药的主要原因,同时细菌对药物的外排机制也在其对抗生素耐药过程中发挥了一定的作用.文章对空肠弯曲菌对各类临床常用抗生素的耐药机制做一综述.     

四环素外排泵耐药基因tet40和tet42的研究进展

四环素类药物是发现于上个世纪40年代的一类广谱抗生素,从50年代开始应用于医学临床[1].由于其具有抗菌谱广和毒性低等特点,因而在兽医临床上得到广泛应用,成为用于防治细菌性感染的常见药物.随着药物使用年限的增加,四环素类药物的耐药水平和耐药率也随之增强.有研究显示,分离自猪、牛、人的大肠杆菌O157对四环素的耐药率极高(97%,100%,100%)[2],在184株沙门菌分离株中,四环素的耐药率达到了66%[3].     

舒巴坦、利血平、乙二胺四乙酸二钠对鸭源大肠杆菌抗菌药物敏感性的影响

本试验旨在研究β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦、外排泵抑制剂利血平及膜通透促进剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)对鸭源大肠杆菌抗菌药物敏感性的影响。采用微量肉汤稀释法测定8株多重耐药鸭源大肠杆菌对头孢噻呋钠、恩诺沙星、阿米卡星、氟苯尼考、多西环素及其与舒巴坦、利血平和EDTA联用的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,舒巴坦能使5株鸭源大肠杆菌对头孢噻呋钠的MIC值下降4倍以上;利血平仅能使3株菌株对头孢噻呋钠的MIC值下降4倍以上;而EDTA能使7、5、3、6、8株菌对以上5种药物的MIC下降4倍以上;舒巴坦+利血平使4株菌株对头孢噻呋钠的MIC下降4倍以上,使5株菌株对氟苯尼考的MIC下降4倍以上;舒巴坦+EDTA使鸭源大肠杆菌对以上5类药物的MIC大幅度下降,分别使8、5、2、8、8株菌MIC下降4倍以上;利血平+EDTA使7株菌株对恩诺沙星MIC下降4倍以上,使所有分离株对其余4种药物的MIC显著下降;舒巴坦+利血平+EDTA和5类药物联用后,所用分离株的MIC下降4倍以上。由此可见,引起鸭源大肠杆菌对以上抗菌药物的耐药原因主要包括细胞膜通透性的下降、药物的主动外排作用和产生β-内酰胺酶的破坏作用,三者相协同提高了鸭源大肠杆菌的耐药水平。     

大肠杆菌外排泵系统基因表达及ELISA检测方法建立

 【目的】对大肠杆菌AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因进行原核表达，获得的表达产物AcrA、AcrB蛋白分别免疫兔，制备相应的抗体，建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【方法】扩增AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因片段，扩增片段分别与原核表达载体 pET-41a(+)连接构建重组质粒，于BL21（DE3）中进行诱导表达。表达产物AcrA、AcrB纯化后分别免疫新西兰大白兔，获得抗AcrA、AcrB抗血清，并用Western blot方法对表达产物进行鉴定分析。纯化的AcrA、AcrB蛋白分别按不同的浓度包被酶标板，与不同稀释倍数的抗血清反应，通过ELISA检测确定最佳抗原包被浓度及抗体稀释度，初步建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【结果】成功克隆和表达了 acrA、acrB基因片段，经 SDS-PAGE检测表明两种表达产物 AcrA、AcrB均以可溶性蛋白形式存在。AcrA、AcrB抗原蛋白最佳包被浓度分别为 1.0μg?ml-1和0.5μg?ml-1，抗AcrA、AcrB血清的最佳稀释度分别为1﹕800和1﹕400。用初步建立的ELISA方法检测8株大肠杆菌多重耐药菌株外排泵表达水平，结果表明分别用两种蛋白作包被抗体检测外排泵表达水平的结果一致。【结论】本研究通过原核表达的方法获得大肠杆菌AcrAB外排泵系统AcrA、AcrB蛋白并制备了相应的抗体，分别用两种抗体包被酶标板，并建立了大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法，对8株多重耐药菌株的检测结果表明该方法可行、可靠。     

耐药猪链球菌膜蛋白图谱分析及能量抑制剂对其敏感性的影响

为证实国内临床分离的动物源链球菌菌株中是否存在与红霉素耐药性相关的主动外排机制,选取含有mefA基因和ermB基因和不含mefA/ermB基因的链球菌耐药菌株和青霉素、红霉素均敏感菌株,在能量抑制剂氰氯苯腙(CCCP)存在时,采用棋盘法分析红霉素、阿齐霉素、替米考星、青霉素对分离菌MIC的影响,并采用SDS-PAGE电泳分析分离株的膜蛋白图谱.结果显示:CCCP可对含有mefA基因的耐药菌株产生影响,可增强其对红霉素、阿齐霉素的敏感性,但不影响其对替米考星和青霉素的敏感性.含有ermB基因、不含mefA/ermB基因的耐药菌,对红霉素、阿齐霉素、替米考星和青霉素的敏感性不受CCCP的影响.菌株膜蛋白的SDS-PAGE电泳图谱显示,含有mefA基因的耐药菌株与其他菌株的膜蛋白图谱差异较大,其膜蛋白条带多而深浓,在45 000处有明显的条带,其他菌株无该条带,推测该蛋白可能是膜主动外排的相关蛋白.本试验结果佐证了在链球菌内存在与红霉素耐药相关的主动外排机制.     

主动外排系统介导的乳中双歧杆菌耐药性的确证

了解双歧杆菌对环丙沙星的耐药关系,确证其耐药机制——外排系统的存在。对双歧杆菌标准菌株和从酸奶中分离的4株双歧杆菌菌株进行环丙沙星的耐药性试验,从中筛选出耐药菌株,再用质子泵抑制剂2,4-二硝基酚结合荧光分光光度法检测了耐药菌株和标准菌株对环丙沙星的摄取情况。通过对比2,4-二硝基酚存在与否菌体对环丙沙星的摄取量变化,从而确证了双歧杆菌外排系统的存在。实验表明：双歧杆菌有外排系统作用介导的对环丙沙星耐药的机制。     

副猪嗜血杆菌15个血清型参考菌株acrA基因序列分析

acrA基因在细菌多重耐药中起重要作用.利用PCR扩增副猪嗜血杆菌15个血清型标准菌株acrA基因,应用Clustal W进行氨基酸进化距离分析和同源性分析,绘制进化树.序列测定与分析表明,ac-rA基因在副猪嗜血杆菌15个标准菌株中都存在,其中,血清5型、8型、14型有2个拷贝(acrA1和acrA2).进化距离分析表明不同血清型之间AcrA1氨基酸序列有较大的差异,同源性为89.8％～100％.同一血清型副猪嗜血杆菌acrA1和acrA2氨基酸同源性低于30％,但都位于比较保守的基因座上,这是首次发现副猪嗜血杆菌会存在2个acrA基因.本研究为副猪嗜血杆菌多重耐药机制的研究提供了理论基础,同时对新型抗菌药物的研发也具有重要的参考价值.     

大肠杆菌acrR插入序列对acrAB表达水平及多重耐药性的影响

为研究大肠杆菌(E.coli)分离株ED28的acrR基因中777bp插入片段对外排泵AcrAB表达水平及多重耐药性的影响,本研究将野生型acrR通过互补实验导入ED28中得到C-ED28。通过药物的最低抑菌浓度(MIC)测定、有机溶剂耐受性试验和实时定量PCR(qPCR)等方法检测菌株中AcrAB外排泵的活性。通过PCR方法检测ED28和C-ED28喹诺酮耐药决定区(QRDR)的氨基酸突变及携带的质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因。结果显示,临床分离菌株ED28对12种抗生素呈多重耐药表型,而互补菌株C-ED28恢复了对多种药物的敏感性。当能量抑制剂(CCCP)存在时,喹诺酮类和β-内酰胺类药物对ED28的MIC普遍降低,而对C-ED28的MIC保持不变。ED28对染料溴化乙锭(EB)的MIC为512μg/mL,对正己烷和环己烷耐受;而C-ED28对染料EB的敏感性增强,MIC为16μg/mL,对正己烷耐受,对环己烷不耐受。qPCR结果显示,基因acrA和acrB在C-ED28中的表达水平低于亲本菌株ED28,而基因marA在C-ED28中的表达水平高于ED28。靶位突变检测和耐药基因检测结果显示,ED28存在gyrA(Ser83Leu和Asp87Asn)和parC(Ser80Ile)双突变,携带aac(6’)-Ib-cr、blaCTX-M-27和blaTEM-13个质粒编码耐药基因;而C-ED28仅存在gyrA(Asp87Asn)一个突变位点,并丢失aac(6’)-Ib-cr、blaTEM-1两个基因。