转基因棉花GHB119品系特异性定量PCR检测方法的建立

为了保障和促进我国口岸进口转基因产品安全相关法律法规的顺利实施,针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的棉花品系GHB119,本研究利用TaqMan实时荧光PCR(Real-time PCR)技术,根据转基因棉花(Gossypium sp.)GHB119 3'端外源插入片段与棉花基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,并对引物、探针以及扩增体系进行了筛选和优化,建立了转基因棉花GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法特异于转基因棉花GHB119成分检测,检测下限(limit of detection,LOD)为10拷贝的基因组DNA,定量下限(limit of quantification,LOQ)为25拷贝GHB119基因组DNA,对盲样的定量结果显示,测定值与设定值间的偏差(bias)、标准偏差(standard deviation,SD)、相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)等均在可接受范围内。本研究建立的GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确地对混合样品中转基因棉花GHB119成分进行定量检测分析。  

基因宏阵列和荧光定量PCR方法对西瓜枯萎病害土壤中尖孢镰刀菌的快速检测和定量

采用基因宏阵列(Macroarray)和荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法,对引起西瓜枯萎病害的病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行了快速监测和快速绝对定量,并且对实验条件进行了优化和摸索。结果显示,在西瓜枯萎病害发病较为严重的处理N-+P-和N-+P+的根际土壤中,Macroarray检测到强烈的阳性信号,表明尖孢镰刀菌的大量存在,同时荧光定量PCR的结果也表明在这两个处理的根际土壤中尖孢镰刀菌数量最多,分别为每g土壤8.89×105和2.24×105个拷贝数;而在未发生枯萎病害的处理N++P-和N++P+中,Macroarray未检测到阳性信号,根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别为每g土壤6.23×103和3.28×103个拷贝数;而四个处理的土体土壤中尖孢镰刀菌的数量均维持在每g土壤102～103个拷贝数,Macroarray未检测到阳性信号。与传统检测方法如病原菌的分离培养、平板稀释计数等相比,上述分子生物学方法对病原真菌的检测和定量更为准确快速、省时省力。  

不同化感潜力水稻品种对低钾的生理与分子响应

选择国际公认的化感水稻品种“P1312777”和非化感水稻品种“Lemont”为材料，在K元素为5mg·L^-1（低K）和40mg·L^-1（正常K）2个水平的营养液中培养，通过水稻形态学指标（根长、株高、根冠比和生物量）、生理生化指标（SOD、POD、CAT、根系活力及植株中N、P、K含量），评价不同化感潜力水稻品种对低K胁迫的生理响应，并采用实时荧光定量PCR（Realtime Fluorescent Quantitative PCR，FQ-PCR），分析了低K胁迫下水稻根和叶中与N、P、K吸收利用相关的12个关键酶的基因表达差异。结果表明，低K促进了化感水稻“P1312777”根的生长，根冠比加大，生物量增加，但对株高的影响不显著；而该条件下非化感水稻“Lemont”的上述指标均受到不同程度的抑制。低K对两种水稻的保护酶系（SOD、POD、CAT）和根系活力均有一定程度的抑制作用，植株中N、P、K含量降低，但非化感水稻“Lemont”受抑制的程度远大于化感水稻“P1312777”。FQ-PCR检测结果表明，低K胁迫下两种水稻根、叶中的12个关键酶的基因均呈现上调表达，而化感水稻“P1312777”的基因表达上调倍数均明显大于非化感水稻“Lemont”。低K胁迫下两种水稻品种的形态学差异、生理与分子响应均表明，化感水稻“P1312777”比非化感水稻“Lemont”具有更强的适应K匮乏的能力。  

不同价态无机砷胁迫下水稻秧苗的营养生理与分子响应

为揭示水稻秧苗响应砷胁迫的营养生理机制,以"汕优63"为受体材料,采用水培方法研究了水稻秧苗在不同价态无机砷胁迫下其形态学指标(根长、株高和干重)及植株中N、P、K含量等生理响应,并采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)分析了不同价态无机砷胁迫下水稻秧苗根和叶中与N、P、K吸收相关的4个关键酶基因的表达差异.结果表明,砷胁迫可显著降低水稻的根长、株高、干重,As(Ⅲ)的抑制作用大于As(Ⅴ);As(Ⅲ)主要抑制水稻秧苗对磷、钾的积累,而As(Ⅴ)主要抑制氮的积累;不同价态无机砷胁迫下,水稻秧苗根部,叶部与N、P、K吸收相关的基因表达均下调,且As(Ⅲ)主要影响磷酸根离子转运蛋白和钾离子转运蛋白的表达,而As(Ⅴ)则主要影响硝酸根离子转运蛋白和氨离子转运蛋白的表达.可见,不同价态无机砷胁迫对水稻营养生理机制的影响存在差异.  

小麦籽粒胚乳淀粉合成酶基因表达及酶活性分析

为研究小麦籽粒淀粉合成酶基因表达与酶活性的特征,选用4个淀粉含量差异较大的普通六倍体小麦新春24、E28（高淀粉含量组）和宁春16、安农9912（低淀粉含量组）为试验材料,采用实时荧光定量RT-PCR ,对灌浆期籽粒淀粉合成酶相关基因的表达进行研究,并对其表达量与相应酶活性的相关性做了分析。结果表明,束缚态淀粉合成酶基因(GBSS)、可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、淀粉分支酶基因( SBE)、淀粉去分支酶（DBE）基因均呈单峰曲线变化。利用实时荧光定量PCR技术检测9个基因在不同淀粉含量的4个供试品种花后不同时期的相对表达量,结果表明，花后6d这些基因开始表达，在灌浆的中期（花后12~18d不等）有表达的小高峰，但在不同时期，2个高淀粉含量的品种中各种酶活性及其酶基因的相对表达量均比2个低淀粉含量的品种相对较高；这些基因表达谱与酶活性相关分析显示, 除GBSS外其他几种淀粉合成酶基因均与相应酶活性呈显著或极显著正相关，而且GBSS酶活性到达峰值时间稍迟于DBE、SSS、SBE等酶，说明DBE、SSS、SBE基因可能主要通过转录水平来控制籽粒淀粉的合成,而GBSS基因可能主要通过转录后水平来控制籽粒淀粉的合成。  

丝瓜18S rRNA基因克隆及其作为内参基因的应用

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的重要条件.18S rRNA基因表达范围广、表达量恒定,常作为内参基因应用于实时荧光定量PCR中.为了获得丝瓜18S rRNA基因,并设计合适的荧光定量PCR内参引物,解决丝瓜实时荧光定量PCR检测中无内参基因的现状,通过PCR和序列测定,首次克隆到了丝瓜的18S rRNA基因序列,其长度为1 862 bp,GenBank登录号为KM656452.在此基础上设计1对荧光定量PCR引物,该引物特异性强,扩增效率高,在丝瓜各生长发育阶段及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达,适合在丝瓜基因表达研究中作为内参基因.该研究结果可为开展丝瓜重要功能基因的表达模式和调控机制的研究奠定基础.  

菇菜套作对土壤微生物群落的影响

套作是防治连作障碍的有效方法之一,但是蔬菜和可食用菌之间的套作机理研究鲜见报道,尤其是其土壤微生物学机制。本研究建立菇菜套作体系,利用实时荧光定量PCR和PCR-DGGE技术研究土壤细菌和真菌群落的变化。结果表明,菇菜套作显著提高了番茄生物量,且其番茄果实产量最高,硝酸盐含量最低。与对照相比,菇菜套作下土壤细菌和真菌基因拷贝数量均无显著变化;DGGE指纹图谱表明,不同处理下的细菌群落无明显差异,但是菇菜套作下真菌群落结构发生了分异,主要表现为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)代表型条带的强度的下降。  

微生物有机肥防治棉花黄萎病机制研究

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是一种世界范围内具有毁灭性危害的土传真菌,它有着广泛的寄主,包括多种树木、草本植物、蔬菜、粮食和经济作物[1],例如棉花和烟草[2]。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传病害,给棉花生产造成了严重的经济损失,目前该病的控制措施主要关注于如何预防,例如利用抗病品种和尝试生物防治来进行防治[3]。