猪血凝性脑脊髓炎病毒S1蛋白基因在毕赤酵母中的表达

应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用Ec0R I和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαASI。用BstX I酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1％甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。     

LncRNA-NONMMUT131476.1对PHEV复制的影响及其靶基因Nlrc5的验证

长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长达200个以上核苷酸的转录本,在不同组织和发育阶段的表达具有特异性。为筛选与猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)致小鼠神经系统损失相关的LncRNA,本试验对正常小鼠和PHEV感染小鼠大脑皮质进行高通量测序,获得PHEV感染过程中LncRNA差异表达数据。经过生物学分析,发现与PHEV感染相关的LncRNA-NONMMUT131476.1位于小鼠第8号染色体Herpud1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1)和Nlrc5(NLR family,CARD domain containing 5)两基因间,由5个外显子构成。利用qPCR方法对感染PHEV的小鼠脑组织和N2a细胞中LncRNA-NONMMUT131476.1及Nlrc5基因的表达量进行检测,发现LncRNA-NONMMUT131476.1和Nlrc5基因的表达量均呈上调。研究发现干扰LncRNA-NONMMUT131476.1后Nlrc5表达被抑制,表明Nlrc5可能为其潜在靶基因。同时,沉默LncRNA-NONMMUT131476.1表达能促进病毒复制增殖,表明该LncRNA可能作为调节因子,参与调控PHEV感染过程,但其具体机制有待于进一步研究。本试验为PHEV感染发病机制和PHEV防制研究提供新思路。     

羊传染性脓疱病毒趋化因子结合蛋白（CBP）基因的克隆及表达分析

参照GenBank中ORFV的毒力因子CBP基因的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增该基因片段,并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,经PCR、酶切鉴定和测序正确后,转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG进行诱导表达,并通过生物信息学软件进行分析。SDS-PAGE结果可见大小...     

吉林省2006--2010年羊传染性脓疱病的流行病学调查及分析

为了解近年来羊传染性脓疱病在吉林省的流行情况,本试验采用PCR方法对2006—2010年间采自吉林省9个不同市县85个养羊户疑似羊传染性脓疱病毒（ORFV）感染的628份痂皮样本（背部、乳房、四肢以及尾根等部位皮肤）进行羊传染性脓疱病毒核酸的检测,在各市县不同年龄不同品种羊的皮肤痂皮样本中均检测到一定程度的ORFV,平均阳性率为24．36％（153／628）,其中以1～6月龄羔羊的阳性检出率最高。应用间接ELISA方法对同期采集自上述地区羊群中的2160份血清样本进行ORFV抗体检测,其中有852份呈现0RFV抗体阳性反应,平均阳性率为39．44％（852／2160）。以上结果表明,ORFV在吉林省大部分地区羊群中的感染已经非常普遍。     

自噬相关蛋白Beclin-1对PHEV复制增殖的影响

首先利用荧光定量PCR和Western blot的方法分别从基因水平和蛋白表达水平检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomgelitis virus,PHEV)感染细胞对Beclin-1的影响,结果发现随着PHEV感染时间的增加Beclin-1表达呈现明显的上调趋势。其次,利用间接免疫荧光技术检测Beclin-1在PHEV感染后的N2a细胞中的定位变化,发现Beclin-1和PHEV呈现明显的共定位关系。随后构建Beclin-1的真核表达载体pCMV-FlagBeclin-1,将其转染至N2a细胞后接种PHEV,发现PHEV复制增殖特性并未受到显著影响。利用siRNA技术特异性敲低N2a细胞中的Beclin1水平,结果显示PHEV的表达量明显下调。本试验结果揭示了Beclin-1参与调控PHEV复制增殖的重要作用,为深入阐明PHEV致病机制提供了新的思路。     

水泡性口炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将水泡性口炎病毒（VSV）经差速离心和蔗糖密度梯度离心法进行纯化后,以纯化的VSV作为免疫原免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对制备出的抗VSV单抗的特异性、抗体亚类等生物学特性进行鉴定。结果显示,试验成功筛选出2株能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C3。ELISA鉴定结果表明,2株单抗均能特异性地与VSV结合,而与口蹄疫病毒（FMDV）、猪水泡病病毒（SVDV）均不发生交叉反应;诱生小鼠腹水产生的抗体效价可达1∶25 600～1∶51 200。杂交瘤细胞染色体核型鉴定结果显示,杂交瘤细胞染色体数为95～105,均高于2个亲本细胞的染色体数目,说明这2株细胞是两者的杂交产物。抗体亚类鉴定结果显示,所获得2株单抗1A2、4C3均为IgG1。Western blot分析结果表明,1A2可识别VSV G蛋白。2株抗VSV单克隆抗体的成功制备将为VSV快速检测方法的建立以及检测试剂的研制等奠定基础。     

鹅巴氏杆菌病的病原分离鉴定及其病理学观察

通过镜检、培养、琼扩试验、生化鉴定及动物回归等试验,从临床表现为神经症状、眼观主要病变为肝肿大、肝表面和切面有灰白色坏死灶为主要特征的病鹅体内分离出禽多杀性巴氏杆菌,其主要病理组织学变化为部分肝小叶内含有一个或多个凝固性坏死灶;大脑皮层血管周围有多量的中性粒细胞浸润,形成明显"血管套"现象,呈化脓性脑炎变化.通过电镜观察、SPF鸡胚接种和血凝抑制试验等排除了禽流感、新城疫等病毒感染的可能性,为禽巴氏杆菌病的诊断提供了资料.     

羔羊外周血单个核细胞转化MTT比色法最佳检测条件的筛选

为了建立羔羊外周血单个核细胞转化检测的MTT比色法,对影响MTT比色法的3个主要因素(包括刺激原、细胞浓度、培养时间)进行了探索性的研究.结果表明,MTT法检测的最佳条件为:植物血凝素(PHA)浓度为10 pg/mL,细胞密度为1×107个/mL;或者刀豆蛋白A(ConA)浓度为40μg/mL,细胞密度为2×107个/...     

缺失糖基磷脂酰肌醇锚的Doppel 转基因小鼠的构建

将缺失糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol,GPI）的Doppel的质粒（pDoppel 1-155）,用Not Ⅰ酶切,回收并纯化目的基因片段,通过显微注射,导入BALB/c小鼠受精卵的雄原核内,结果32只仔鼠出生,其中有6只PCR检测阳性。将其中1只F0代小鼠与正常小鼠交配,共获得21只F1代小鼠,经PCR检测,有10只仔鼠为阳性。对2只F1代PCR阳性小鼠脑组织进行RT-PCR检测,其中1只为阳性。采集3只F1代PCR阳性小鼠脑组织进行Western blotting检测,在小鼠脑组织能够表达17 ku的Doppel 1-155蛋白。本研究为进一步深入研究Doppel蛋白在体内的生物学特性提供了转基因动物模型。