人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA(amiRNA)干扰载体(该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因)转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强(P0.05)。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

甘蓝型油菜Bn19070的表达与同源基因At2G19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果，油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bn19070与拟南芥At2G19070基因高度同源，在油菜可育株雄蕊中高量表达，不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2G19070入手，利用amiRNAi (人工微RNA干扰)技术对其两个RNA区段分别设计靶标，转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型，基因表达抑制率都在90%以上，干扰效果好，暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2G19070基因的干扰对Bn19070的功能研究有借鉴作用。     

大豆灰斑病菌菌丝块离体叶接种快速鉴定方法的建立

[目的]建立一种室内可重复、快速准确鉴定大豆对灰斑病抗性的方法。[方法]利用大豆灰斑病1号和7号生理小种及6种不同抗性的大豆品种为材料,研究并建立了大豆灰斑病抗性的菌丝块接种快速鉴定方法。[结果]在28℃、12h光照与12h黑暗交替的条件下,Minimal培养基生长的菌丝块接种抗感大豆叶片,菌斑面积明显不同,且鉴定结果与已知抗感品种报道的灰斑病抗性一致。[结论]菌丝块离体叶接种鉴定具有不受生育期和环境条件限制、可重复性强的特点,是大豆灰斑病抗性室内鉴定的一种有效方法。     

甘蓝型油菜显性核雄性不育基因的AFLP标记鉴定

甘蓝型油菜双基因显性细胞核雄性不育系统受一对显性不育基因和一对显性上位抑制基因共同控制，不育单株的基因型为MsMsrfrf和Msmsrfrf。为了在育种过程中高效筛选后代单株基因型，本研究利用一个显性细胞核雄性不育杂合两型系70056AB（Msmsrfrf×msmsrfrf）构建的兄妹交分离群体，采用AFLP技术，在480对AFLP引物中筛选到一个与不育基因紧密连锁的分子标记P9M14-130。利用P9M14-130引物对70056AB的88个单株进行检测，发现该标记与雄性不育基因间的交换率为1.1％。     

抗,感菌核病油菜品种几种酶活性对草酸处理的响应

以抗病油菜品种７８３和感病品种８４０３９为材料，４叶期进行１０ｍｍｏｌ／Ｌ草酸浸根处理不同时间后，对其３种酶活性进行测定。结果表明，抗病品种７８３的过氧化物酶，多酚氧经酶和超氧化物歧化酶活性高于感病品种８４０３９。２个品种叶片中ＰＯＤ，ＳＯＤ的活性都比各自的清水对照高，且抗病品种增加幅度大于感病品种，而ＰＰＯ活性却下降。     

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan-GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料，采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白，对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明，采用理想的蛋白质裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/ L 硫脲，4% CHAPS（3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐），65mmol二硫苏糖醇，0.5% IPG缓冲液 pH 3~10或pH 4~7，全蛋白酶抑制片剂 (片／10 ml)）裂解蛋白，以150μg上样，按IEF程序Ⅱ(30V，12Hr；200V，1Hr；500V，1Hr；1000V，0.5Hr；10000V，2Hr；10000V，80000VHr)进行等电聚焦，10%SDS-PAGE胶浓度进行第二向电泳，银染方法检测，可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。     

枯草芽胞杆菌在油菜根茎叶的定殖动态和生防作用研究

采用常规方法跟踪枯草芽胞杆菌Tu-100在缩影系统油菜根际的定殖情况。Tu-100在油菜不同根段部位的定殖密度从上到下呈现了逐渐递减的规律。随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段8cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后3d，定殖密度可达最高水平（8.3×105 个/g），然后急速下降，30d后保持相对稳定的较低水平（1.3×102 个/g）。 在油菜三片真叶时喷雾接种一次，20d后，在茎和叶上不能检测到所接种的Tu-100，并且抗菌核病的能力也逐渐减弱。     

油菜抗病毒病与过氧化物酶关系

用于叶期苗在不接种病毒条件下测试过氧化物酶同工酶结果,在相对迁移率17％—47％内,有6个位点出现酶带,抗、感病品种的酶带数量、酶带出现的位点和强弱程度有明显差别。高抗品种酶带数最多,有E_3和E_4强带,E_3为弱带;高感品种酶带数最少,缺E_6和E_4,E_3为强带;低抗和低感品种的酶带介于高抗与高感品种之间。用酶带数量和各酶带强弱程度,或用酶谱薄层扫描积分值计算距离系数,而后聚类,聚类结果与抗、感病性分组完全一致。证明抗病性与过氧化物酶同工酶有密切关系,用不接种苗酶谱测定可以代替接种鉴定和田间鉴定。     

甘蓝型油菜抗菌核病扩展的遗传分析

以核盘菌菌丝体接种11个油菜品种（系）的离体叶片，结果表明不同品种间病斑大小差异显著，病斑随接种后时间延长呈逻辑斯蒂曲线增长，抗、感品种之间抗病斑扩展的差异显著，条件方差分析表明，草酸浸根处理第3d到第4d，油菜抗毒素的条件广义遗传力达0．784；草酸浸叶柄处理第3d到第4d，加性方差占总方差23．1％，处理第4d到第5d加性方差下降为0，表明条件加性效应值和条件显性效应值在不同的时段是不同的。     

甘蓝型油菜BnEIN3基因的克隆及菌核病诱导表达研究

乙烯不敏感转录调节基因（EIN3）是定位于细胞核上的乙烯信号转导下游元件，其作为转录因子启动一系列转录级联反应，从而激活乙烯诱导的防御相关基因的表达。拟南芥EIN3功能缺失突变体表现出对死体营养型病原菌高度敏感，表明该基因在抗死体营养型病原菌中发挥一定作用。为克隆甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因，该研究采用荧光定量PCR研究菌核病不同抗性的油菜品种接种核盘菌后，BnEIN3的表达变化及差异，初步探讨了BnEIN3在油菜菌核病防卫反应中的作用。