家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

家蚕孤雌生殖差异脂蛋白30K lipoprotein precursor基因的克隆与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离家蚕孤雌生殖蚁蚕总蛋白,并和正常蚁蚕总蛋白进行比较,得到46个可能与家蚕孤雌生殖相关的差异蛋白点。对这些差异蛋白点进行胶内酶解后基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOFMS)分析,经数据库搜索鉴定,确定其中一个差异蛋白点为脂蛋白30K lipoprotein precursor(30K LPP)。通过5′-RACE技术克隆到30KLPP脂蛋白的全长cDNA序列。生物信息学分析显示该差异蛋白基因全长917bp,编码261个氨基酸,理论分子质量为30.013kD,等电点为7.193;结构域和三级结构预测显示该蛋白包含1个Lipoprotein-11结构域和12个β-折叠。预测其信号肽概率为1.000,定位在1~20aa区域,即可能存在信号肽。细胞定位预测显示该蛋白可能分泌到胞外(SP值为0.934)。分析结果有助于进一步研究30KLPP脂蛋白结构与功能的关系。     

家蚕脂围蛋白(PLIN)基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。     

家蚕JAB1/CSN5蛋白的基因克隆表达及亚细胞定位

JAB1/CSN5是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalosome CSN)的第5个亚基,内嵌的JAMM基序是CSN参与蛋白的泛素化降解途径并调控生物体生长发育过程的异构酶活性位点。在家蚕蛹cDNA文库中筛选到的一条基因序列,其ORF长度为1047 bp,预测编码蛋白含有JAB1/CSN5保守结构域JAB-MPN,因此命名为BmJM。将BmJM基因的ORF插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmJM,于E.coliRosetta菌中进行原核表达,重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得BmJM的多克隆抗体,采用RT-PCR、Western blotting方法对BmJM基因在家蚕不同发育时期和组织中的转录及蛋白表达水平进行分析,发现BmJM蛋白在家蚕5龄幼虫的生殖腺表达量最高,而在其他组织中表达量较少,由此初步揭示了JAB1/CSN5在家蚕生长发育过程中的作用。亚细胞定位测定表明BmJM蛋白在细胞质近核区域含量最高,在细胞核中也有分布。     

放射性核素~(95)Zr在土壤中吸附的研究

应用同位素示踪技术,研究了95Zr在小粉土、黄红壤、青紫泥和海泥中的吸附。结果表明,95Zr进入淹水土壤之后,将迅速地被土壤吸附而达到吸附平衡。不同土壤有不同的饱和吸附率,就它们吸附95Zr能力来说,海泥>青紫泥>小粉土>黄红壤。还测定了吸附等温线。     

95Zr在鲫鱼体内的分布及在水生生态系统中的消长动态

采用同位素示踪技术研究了鲫鱼对~(95)Zr的吸收和在其体内的分布动态以及95Zr在水生生态系统中的行为特性,并运用非线性拟合方法建立其数学模型。结果表明:(1)从水体中引入的95Zr由于沉降、土壤吸附、被鱼体摄入和金鱼藻的吸收、吸附作用使水体中的95Zr比活度呈快速下降,其消失动态符合二项指数衰减规律,Cw=43.36e-1.7439t 12.85e-0.1467t。(2)金鱼藻对95Zr有较强的吸收、吸附能力,其比活度变化动态(1～28d)符合单项指数衰减规律,Ch=166.69e-0.0361t,其浓集系数(CF值)随时间而增大,至试验结束时(28d)高达321.12。(3)鲫鱼从水体中摄入和吸收95Zr的主要器官是肠胃道(内脏),与水体直接接触而吸附、吸收的95Zr主要集中在鱼鳃和鱼鳍中,肉、骨和鱼卵中的比活度较低(略高于本底水平),表明通过肠胃道摄入和鳃、鳍等组织吸附、吸收的95Zr不易向肉、骨和鱼卵等内部组织输运,指数回归分析表明鲫鱼(全鱼)中95Zr的变化动态符合二项指数规律,C=12.12(e-0.2045t-e-1.4470t).     

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。     

95Zr在水-土体系中的消长动态研究

采用同位素示踪技术进行了95Zr在六种水—土体系中的消长动态研究 ,并应用非线性回归方法确定了各体系的拟合方程。结果显示 :1 .水体中的95Zr比活度起初随时间呈快速下降 ,而后逐渐趋缓 ,不同水—土体统中的下降速率各不相同 ,表明底泥对95Zr有强烈的吸附作用 ,其吸附强弱顺序为 :泮畈红壤 >海盐红壤 >青紫泥 >小粉土 >海泥 >黄沙 ;2 .底泥中95Zr的比活度随时间呈同步增加 ,并在经历一段时间后达到一平衡值 ,不同底质土壤达到平衡的时间各不相同 ,其平衡时间的大小顺序为 :海盐红壤 (1 3.1 0d) <泮畈红壤 (1 5 .53d)<黄沙 (1 5 .64d) <青紫泥 (1 7.85d) <小粉土 (2 0 .65d) <海泥 (2 1 .46d) ;3 .对各体系的消长动态拟合方程进行方差分析 (测定系数r2 、置信区间 ) ,表明各回归方程较好地反应了95Zr在水体和底质土壤中的行为过程。     

放射性核素~(95)Zr在土壤中吸附的研究

应用同位素示踪技术研究了95Zr在小粉土、黄红壤、青紫泥和海泥中的吸附 ,并研究了不同比活度95Zr对土壤吸附比的影响 ,测定了吸附等温线。结果表明 ,95Zr进入淹水土壤后迅速被土壤吸附达到吸附平衡。不同土壤有不同的饱和吸附率 ,海泥 >青紫泥 >小粉土 >黄红壤     

放射性锆在红壤中的淋溶特性研究

采用模拟土柱法研究了放射锆（^95Zr)在两种红壤（泮畈红壤和红黄壤）中的淋溶特性和垂直迁移。结果显示：1）淋溶收庥水中^95Zr的含量甚微，接近于0，且随着总淋溶水量的增加（250-750ml)，淋溶水中^95Zr的总量几乎没有变化，表明^95Zr一旦被土壤吸附，则不易被水流解吸；（2）滞留于土壤中的^95Zr绝大部分分布在土壤表层，泮畈红壤和红黄壤分别有90.05%-97.47%和96.02%-97.16%的^95Zr滞留于0-0.4cm土层范围内，表明二种红壤^95Zr均有较强的吸附能力；比较其变化动态，红黄壤对^95Zr的吸附能力略强于泮畈红壤。